AVT為大家?guī)韼卓钚滦妥⑸浼夑栯x子脂質(zhì)材料,，包括DMG-PEG2000，DOTMA等,，本期AVT小編給大家分享一下DOTMA和DOPE在脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染實驗中的應用,，好奇的小伙伴速來圍觀！

 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染實驗步驟

 脂質(zhì)體(LR)試劑是陽離子脂質(zhì)體DOTMA和DPE的混合物(1:1),。它適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細胞中,，是目前條件下最方面的轉(zhuǎn)染方法之轉(zhuǎn)染率高，優(yōu)于磷酸鈣法,，比它高5-100倍,，能把DNA和RNA轉(zhuǎn)染到各種細胞。用LR進行轉(zhuǎn)染時,，首先需要優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件,，應找出該批LR對轉(zhuǎn)染某一特定細胞適合的用量,、作用時間等，對每批LR都要做,，先要固定一個DNA的量和DNA/LR混合物與細胞相互作用的時間,，DNA可從1-5ug和孵育時間6h,開始按這兩個參數(shù)繪出相應LR需用量的曲線，再選用LR和DNA兩者佳的劑量,，確定出轉(zhuǎn)染時間,，因LR對細胞有一定的毒性，轉(zhuǎn)染時間以不超過24h為宜,。

 細胞種類：C0-7,、BHK、NIH-3T3,、Hela和 Jurkat等任何一種細胞均可作為受體細胞,。

 1、操作步驟(方法一)

 1）取6孔培養(yǎng)板,，向每孔中加入2m1含(1-2)x105個細胞的培養(yǎng)基,，37℃、18%C02培養(yǎng)基40%-60%匯合時,。

 2)轉(zhuǎn)染液制備：在聚苯乙烯管中制備以下兩液(為轉(zhuǎn)染1個空細胞所用的A液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋DNA使?jié)舛葹?-10ug,終量100u1,。B液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋LR,使終濃度為2-50ug,終量100u1輕輕混合A液、B液,，室溫中置10-15min,稍后會岀現(xiàn)微濁現(xiàn)象,，但并不妨礙轉(zhuǎn)染

 3)轉(zhuǎn)染準備：用2m1不含血清培養(yǎng)基漂洗2次，再加入1m1不含血清培養(yǎng)基

 4)轉(zhuǎn)染：把AB復合物緩緩加入培養(yǎng)基中,，搖勻,，置37℃溫箱中6-24h吸除無血清轉(zhuǎn)染液，換入正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)

 5)其余處理：如觀察,、篩選、檢測等與其他轉(zhuǎn)染法相同

 6)注意：轉(zhuǎn)染時切勿加血清,，血清對轉(zhuǎn)染效率有很大影響,。

 2、快速脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法操作步驟(方法二)

 ●……將細胞以5x105個/孔接種于6孔板中培養(yǎng)24h,使其達到50%-60%板底面積,。

 ●……在試管中配制DNA-脂質(zhì)體復合物

a,、在1m1無血清DMEM中稀釋PSV1-neo質(zhì)粒DNA或供體DNAb、旋轉(zhuǎn)1s,再加入脂質(zhì)體懸液,，旋轉(zhuǎn),。

c、室溫下放置5-10min,使DNA結(jié)合在脂質(zhì)體上,。

 ●……棄去細胞中的舊液,，用1m1無血清DMEM洗細胞1次后棄去,，向每孔中直接加入1m1DNA-脂質(zhì)體復合物，37℃培養(yǎng)3-5天再于每孔中加入含20%胎牛血清的DMEM,繼續(xù)培養(yǎng)14-24h,。吸出DEM-DNA-脂質(zhì)體混合物加入新鮮含10%胎牛血清的DMEM,2m1/L,再培養(yǎng)24-48h,。用細胞刮或消化法收集細胞，以備分析鑒定

 3,、穩(wěn)定的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法

 ●……接種細胞同前述,，細胞長至50%

 ●……DNA-脂質(zhì)體復合物制備轉(zhuǎn)染細胞同前。

 ●……在每孔中加入1m1含20%胎牛血清的DMEM,37℃培養(yǎng)48h,。

 ●……吸出DEM,用G418選擇性培養(yǎng)基稀釋細胞,，使細胞生長一定時間篩選轉(zhuǎn)染克隆，方法參照細胞克隆篩選法進行,。

 細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)總述

 一,、細胞轉(zhuǎn)染途徑

 轉(zhuǎn)染大致可分為物理介導、化學介導和生物介導三類途徑,。電穿孔法,、顯微注射和基因槍屬于物理介導技術(shù)；化學介導方法很多,，如經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀,；

 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法、和多種陽離子物質(zhì)介導的技術(shù),；生物介導方法,，有較為原始的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染，和現(xiàn)在比較多見的各種病毒介導的轉(zhuǎn)染技術(shù)

 1,、物理介導

 1）電穿孔法：靠脈沖電流在細胞膜上打孔而將核酸導入細胞

 優(yōu)點：轉(zhuǎn)染效率較高

 缺點：需要昂貴的儀器(電穿孔儀),；對細胞的損傷較大，每次轉(zhuǎn)染需要

 更多的細胞和DNA;每種細胞電轉(zhuǎn)的條件都需要進行多次優(yōu)化

 2)顯微注射：借助顯微注射器直接把DNA注入核內(nèi),，使之整合入受體細胞基因組中

 優(yōu)點：轉(zhuǎn)染效率高,，可用于瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

 缺點：導入DNA時需要一個細胞一個細胞注射，不適合大量轉(zhuǎn)染

 3)基因槍：依賴攜帶了核酸的高速粒子將核酸導入細胞內(nèi)2,、化學介導

 2,、化學介導

 (1)磷酸鈣共沉淀法

 磷酸鈣有利于促進外源DNA與靶細胞表面結(jié)合，氯化鈣+DNA+磷酸緩沖液按定的比例混和,，形成極小的磷酸鈣-DNA復合物沉淀黏附在細胞膜表面,，借助內(nèi)吞作用進入細胞質(zhì)。沉淀顆粒的大小和質(zhì)量對于轉(zhuǎn)染的成功至關(guān)重要,。

 優(yōu)點:能用于任何DNA導入哺乳類動物,，瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。

 缺點:轉(zhuǎn)染效率低:進入細胞的DNA只有1 %- 5 %可以進入細胞核，其中只有不到1%的DNA可以與細胞DNA整合,在細胞中進行穩(wěn)定表達,。重復性不佳:pH值,、鈣離子濃度、DNA濃度,、沉淀反應時間,、細胞孵育時間乃至各組分加入順序和混合的方式都可能對結(jié)果產(chǎn)生影響。

 (2)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法

 中性脂質(zhì)體是利用脂質(zhì)膜包裹DNA,，借助脂質(zhì)膜將DNA導入細胞膜內(nèi),。帶正電的陽離子脂質(zhì)體，DNA 并沒有預先包埋在脂質(zhì)體中,，而是帶負電的 DNA自動結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體上,，形成DNA-陽離子脂質(zhì)體復合物，從而吸附到帶負電的細胞膜表面,，經(jīng)過內(nèi)吞被導入細胞,。

 優(yōu)點:適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細胞，可用于瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染;轉(zhuǎn)染效率高,，比磷酸鈣法高5-100倍;能夠把DN A和R N A轉(zhuǎn)染到各種細胞,，轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定性好，可重復性高,，轉(zhuǎn)染時好不加血清和抗生素,。

 缺點:陽離子脂質(zhì)體細胞毒性相對較高，對部分細胞可能會干擾細胞的代謝,。

 (3)多種陽離子物質(zhì)介導

 DEAE-葡聚糖介導的轉(zhuǎn)染,，其原理還不清楚，可能是通過內(nèi)吞噬作用而使DNA轉(zhuǎn)導進入細胞核,，此法只適合暫時轉(zhuǎn)染實驗,，轉(zhuǎn)染效率與DEAE-葡 聚糖濃度以及細胞與DNA/DEAE-葡聚糖混合液接觸時間的長短很有關(guān)系，可采用較高濃度的細胞與DNA/DEAE-葡聚糖混合液接觸時間的長短很有關(guān)系,，可采用較高濃度的DEAE-葡聚糖(1g/L)作用較短時間(30 分鐘-1.5小時),也可用較低濃度(250g/L)的DEAE-葡聚糖作用較長時間(8小時),。

 3、生物介導

 病毒介導的轉(zhuǎn)染:以病毒作為載體,通過病毒感染的方式將外源DNA導入到細胞中,，其中以逆轉(zhuǎn)錄病毒及腺病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)很是常用,。

 優(yōu)點:整和效率高，可使外源基因在宿主細胞中長期表達,，適用于難以轉(zhuǎn)染的原代細胞。

 缺點:存在潛在的安全危險性,。

 二,、理想的細胞轉(zhuǎn)染方法

 理想細胞轉(zhuǎn)染方法，應該具有轉(zhuǎn)染效率高、細胞毒性小,、重復性好,、安全、簡單等優(yōu)點,。病毒介導的轉(zhuǎn)染技術(shù),，是目前轉(zhuǎn)染效率zui高的方法，同時具有細胞毒性很低的優(yōu)勢,。但是,，病毒轉(zhuǎn)染方法的準備程序復雜，常常對細胞類型有很強的選擇性,，在一般實驗室中很難普及,。其它物理和化學介導的轉(zhuǎn)染方法，則各有其特點,。

 三,、細胞轉(zhuǎn)染分類

 瞬時轉(zhuǎn)染:是指外源基因進入受體細胞后，存在于游離的載體.上,，不整合到細胞的染色體上,。

 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染: DNA 整合到宿主細胞的染色體中。

 四,、報告基因

 是一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因,，是一個其表達產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。把它的編碼序列和基因表達調(diào)節(jié)序列相融合形成嵌合基因,，或與其它目的基因相融合,，在調(diào)控序列控制下進行表達，從而利用它的表達產(chǎn)物來標定目的基因的表達調(diào)控,。

 常用的報告基因系統(tǒng):半乳糖苷酶報告系統(tǒng),、素酶報告系統(tǒng)、蛋白報告系統(tǒng)(GFP)等,。

 五,、轉(zhuǎn)染方法

 實驗用的是Invitrogen公司的Lipofectamine2000在24孔板轉(zhuǎn)染單層貼壁細胞。

 1,、轉(zhuǎn)染前1天將0.5~2X105細胞接種于24孔培養(yǎng)板,，并加入500ul不含抗生素的*培養(yǎng)基，以保證轉(zhuǎn)染時細胞匯合達90~95%,。

 2,、準備復合物

 (1)將0.8ugDNA稀釋于50ul無血清無抗生素的培養(yǎng)液中輕輕渾勻。

 (2)將 2ul Lipofectamine2000稀釋于50u1無血清無抗生素的培養(yǎng)液中,，輕輕渾勻,，室溫孵育5分,。注意:必須在25分內(nèi)進行。

 (3) 5 分后將它們混合,，并輕輕渾勻,，室溫孵育20分。

 3,、吸去培養(yǎng)板的培養(yǎng)基,，用PBS或無血清培養(yǎng)基清洗細胞2次。

 4,、將復合物(總體積100u1)加入培養(yǎng)孔,，前后搖動培養(yǎng)板使其分布均勻。

 5,、將細胞放入培養(yǎng)箱孵育4~6h后,，可以更換含血清培養(yǎng)液去除復合物(也可不用)。

 6,、24~ 48h后可以觀察轉(zhuǎn)入基因表達情況,。

 7、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染:換含血清培養(yǎng)基24h后將細胞以1: 10 (或更高比例)傳代,，1天后更換篩選培養(yǎng)基篩選,。

 8、優(yōu)化:要保證細胞匯合率達90~95% (比較高) ; DNA/ Lipofectamine2000比率1: 0.5~1: 5,，一般細胞1: 2~3,。