分析mRNA 穩(wěn)定性

由于 mRNA 的完整性和純度對(duì)于保障 mRNA 疫苗的有效性和安全性至關(guān)重要,，因此擁有監(jiān)測(cè)這方面的工具非常重要,。mRNA分子的各種屬性共同決定了產(chǎn)品是否可以正常發(fā)揮作用,。Poveda等人的綜述重點(diǎn)介紹了這些屬性,，并簡(jiǎn)要介紹了通常用于評(píng)價(jià)和監(jiān)控它們的方法,。

表3提供了完整的分析評(píng)價(jià)方法列表,，用于確定和監(jiān)測(cè) mRNA 疫苗原料藥和終藥品的質(zhì)量屬性和穩(wěn)定性,。目前在公開資料中仍然無法獲得已獲批使用的mRNA-LNP疫苗產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，泄露的相關(guān)文件中提到mRNA 完整性的百分比應(yīng)在70% 到 75% 之間,，EMA 的評(píng)估報(bào)告寫道：“在當(dāng)前大流行的緊急情況下提交的這種醫(yī)藥產(chǎn)品的質(zhì)量被認(rèn)為是足夠一致和可接受的,。"

表3 測(cè)定和監(jiān)測(cè) mRNA 原料藥和 mRNA-LNP產(chǎn)品質(zhì)量屬性和穩(wěn)定性。

縮寫：AF4,，非對(duì)稱流場(chǎng)-流分餾,；AFM，原子力顯微鏡,；dsDNA,，雙鏈 DNA；DLS,，動(dòng)態(tài)光散射,；ESEM，環(huán)境掃描電子顯微鏡,；IEX-HPLC,，離子交換高效液相色譜；IP-HPLC,，離子對(duì)高效液相色譜,；MALS，多角度光散射,；NTA ,，納米粒子追蹤分析；qPCR,，定量聚合酶鏈反應(yīng),；RP-HPLC，反相高效液相色譜；SE-HPLC,，體積排阻高效液相色譜,；TEM，透射電子顯微鏡,；TRPS,，可調(diào)電阻脈沖感應(yīng)。

在這里,，我們?cè)敿?xì)介紹了適用于研究 mRNA 完整性和用于質(zhì)量控制 (QC) 的技術(shù),。Schmidt 概述了歐盟當(dāng)局要求的以 mRNA 疫苗為重點(diǎn)的研究藥品檔案 (IMPD) 的質(zhì)量文件，感興趣的讀者可以參考該信息性文件了解詳細(xì)信息,。由于許多描述的方法旨在檢測(cè)裸露的 mRNA,，而mRNA 疫苗包封在 LNP中，因此對(duì)于某些檢測(cè),，首先需要從LNP 中釋放出mRNA,，可以通過適當(dāng)?shù)目刂苼砜紤]此過程的潛在影響。

凝膠電泳是一種常用的技術(shù),，可以提供有關(guān) mRNA 大小和完整性的信息,。當(dāng) mRNA 降解并發(fā)生鏈斷裂時(shí)，mRNA 鏈變短,。因此,，預(yù)期 mRNA 長(zhǎng)度處的條帶強(qiáng)度會(huì)降低或條帶會(huì)變寬，同時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)新的條帶,。

Démoulins等人使用凝膠電泳法分析了在無RNase 條件下SAM 的質(zhì)量,。根據(jù)凝膠電泳數(shù)據(jù)，他們能夠確定 mRNA 是否具有可接受的質(zhì)量和穩(wěn)定性,，目前已研發(fā)出商用電泳設(shè)備用于 mRNA 的高通量分析,。

張等人報(bào)道了熒光相關(guān)光譜 (FCS) 可用于監(jiān)測(cè) mRNA 大小的變化，主要原理是通過熒光標(biāo)記的mRNA 的布朗運(yùn)動(dòng)來計(jì)算分子量,。然而,，這種技術(shù)需要熒光標(biāo)記，與凝膠電泳相比準(zhǔn)確度并不一定更高,，并且只能檢測(cè)到包括分子量發(fā)生變化的mRNA 降解,，例如鏈斷裂等。

在整個(gè)（生物）制藥行業(yè),，色譜技術(shù)形成了一個(gè)強(qiáng)大的平臺(tái)來監(jiān)測(cè)藥物的純度和穩(wěn)定性,。然而，迄今為止,，用于確定 mRNA 分子純度和穩(wěn)定性的HPLC技術(shù)的開發(fā)進(jìn)展緩慢,。分析大 分子mRNA的成功方案可以在文獻(xiàn)以及闡述 RP-HPLC,、SE-HPLC、IP-HPLC 和 IEX-HPLC 方法的文獻(xiàn)中找到,，其中一些技術(shù)也可用于mRNA 制備純化。IEX-HPLC 可用于測(cè)量游離和LNP 包封的 mRNA,。前面提到的RiboGreen技術(shù)可以建立相同參數(shù)的正交技術(shù),，然而使用相同的mRNA-LNP樣品卻測(cè)定出了不同的含量結(jié)果；與RiboGreen 數(shù)據(jù)相比,，IEX-HPLC 結(jié)果與體內(nèi)數(shù)據(jù)的相關(guān)性更好,。這說明即使是像 RiboGreen 檢測(cè)這樣的成熟技術(shù)，也應(yīng)該根據(jù)具體情況進(jìn)行詳細(xì)驗(yàn)證,。

mRNA 降解也可以通過RT-qPCR進(jìn)行分析,，使用方法可以測(cè)定能轉(zhuǎn)錄成完整目標(biāo)cDNA的mRNA 總量，這表明所有影響這個(gè)過程的因素都可以間接定量檢測(cè),。Brisco 和 Morley對(duì) RT-qPCR技術(shù)進(jìn)行評(píng)估,，認(rèn)為它的定量結(jié)果是可靠的。RT-qPCR技術(shù)的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是能定量檢測(cè)影響轉(zhuǎn)錄的所有類型的降解,，而之前討論的其它技術(shù)只能檢測(cè)mRNA 的大小,。然而，,，RT-qPCR 技術(shù)也有一定的局限性,，由于所用酶存在錯(cuò)誤率，導(dǎo)致結(jié)果有時(shí)不太可靠,。而且RT-qPCR 技術(shù)這目前沒有被廣使用,，并且無法區(qū)分不同類型的降解。

mRNA體外（細(xì)胞內(nèi)）表達(dá)也用于分析mRNA的完整性,，通過使用編碼熒光蛋白的mRNA,，可以通過測(cè)量熒光信號(hào)間接確定mRNA 的完整性。這種方法有助于為生物活性 mRNA-LNP 設(shè)計(jì)和chu方篩選研究提供指導(dǎo),?；蛘撸梢允褂妹嘎?lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA) 或蛋白質(zhì)印跡技術(shù)（WB）來確定編碼非熒光抗原的mRNA 的翻譯功效,。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是它給出了制劑的整體完整性和可能影響 mRNA 轉(zhuǎn)錄的所有因素的總和,。這種方法的局限性是不是很精確，無法明確mRNA破壞的類型,，并且耗時(shí),。