mRNA疫苗的體外穩(wěn)定性

正如之前在背景介紹中提到的,，目前已批準(zhǔn)的 mRNA疫苗流通的主要障礙之一是它們必須以冷凍形式儲(chǔ)存,。在 2–8 °C 的溫度下,，輝瑞/BioNTech 和 Moderna 疫苗分別可穩(wěn)定保存 5 天和 30 天,，兩家公司都為終端使用提供了詳細(xì)的處理說(shuō)明,。有趣的是,，據(jù)報(bào)道 CureVac 的候選疫苗在冰箱溫度和 -60 °C 下可穩(wěn)定 3 個(gè)月。這些是目前發(fā)布了mRNA-LNP長(zhǎng)期儲(chǔ)存條件的制造商,，這種苛刻的溫度要求嚴(yán)重影響了這些疫苗的儲(chǔ)存,、運(yùn)輸和流通。然而,，迄今為止,，在公開(kāi)資料中幾乎沒(méi)有關(guān)于優(yōu)化mRNA 疫苗穩(wěn)定性的信息。本節(jié)旨在概述影響 mRNA-LNP 疫苗成分穩(wěn)定性的因素,，并討論分析評(píng)價(jià)這種穩(wěn)定性的方法,。

mRNA穩(wěn)定性

強(qiáng)烈影響所需儲(chǔ)存條件的主要因素是 mRNA 的穩(wěn)定性。如上文2.1 節(jié)所述,，mRNA 分子的結(jié)構(gòu)經(jīng)過(guò)專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)可以用于增加體內(nèi)靶抗原的翻譯,。mRNA 的特殊性在于，即使是長(zhǎng) mRNA 鏈（通常長(zhǎng)度在 1000 到 5000 個(gè)核苷酸之間）中的一個(gè)核苷酸發(fā)生變化（鏈斷裂或堿基氧化）便會(huì)導(dǎo)致翻譯終止,。這使得 mRNA 疫苗與其他疫苗*不同,，在其他疫苗中，抗原的微小變化不一定對(duì)其功效產(chǎn)生顯影響,。因此,，對(duì)于 mRNA 疫苗，監(jiān)測(cè)整個(gè)分子的完整性是至關(guān)重要的,。

mRNA 降解的方式有多種,，可以分為化學(xué)和物理降解?；瘜W(xué)降解包括 mRNA 分子中化學(xué)鍵的改變,。物理不穩(wěn)定性包括變性（二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的喪失），與變性對(duì)蛋白質(zhì)生物制劑活性的影響不同,，物理不穩(wěn)定性對(duì)mRNA的影響可能不太明顯,。然而，變性還包括聚集和沉淀等變化,，這些變化會(huì)影響mRNA的翻譯表達(dá),。在一篇關(guān)于核酸穩(wěn)定性的綜述中，Pogocki 和 Sch?neich 指出化學(xué)降解在siRNA降解中的影響比物理不穩(wěn)定性更大,，對(duì)于鏈長(zhǎng)更長(zhǎng)的 mRNA來(lái)說(shuō)可能更是如此,。

mRNA在體外的化學(xué)降解主要包括水解和氧化，水解主要是發(fā)生在mRNA 分子骨架的磷酸二酯鍵（圖5 ）,。核糖上的2' OH 基團(tuán)起著至關(guān)重要的作用,，因?yàn)閷?dǎo)致 mRNA 鏈斷裂的酯交換反應(yīng)起始于磷酸酯鍵上的 2'OH 基團(tuán)的親核進(jìn)攻導(dǎo)致 P-O5' 酯鍵斷裂（圖5）,。這個(gè)過(guò)程需要水，可以被核酸酶催化,，也可以被 mRNA 分子本身和其他外源因素如酸和堿催化,。在有關(guān) mRNA 水解的兩篇文獻(xiàn)中，作者指出 mRNA 的堿基序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)影響水解速率,。具體而言,，堿基堆積可能會(huì)降低磷酸二酯鍵的裂解速率，可以小化 mRNA 分子的“平均未配對(duì)概率",?？梢允褂脤?zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)的算法來(lái)選擇可以形成大雙鏈區(qū)域的單鏈 mRNA 的核苷酸序列。據(jù)稱,，采用這種方法優(yōu)化后,，體外穩(wěn)定性得到了改善。

CureVac,、輝瑞/BioNTech 和 Moderna 疫苗之間的區(qū)別在于后兩者具有 1-甲基-假尿苷的單核苷摻入,。之前的一項(xiàng)研究表明，這種修飾提高了 RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,。CureVac 采用提高GC比例策略,，具有類(lèi)似的效果。

圖5 通過(guò) 2',3'-環(huán)狀磷酸酯,，堿基催化RNA分子內(nèi)的磷酸二酯鍵水解,、B表示Br?nsted堿。

相反,，氧化會(huì)影響堿基,，并在較小程度上影響mRNA 核糖單位的糖基團(tuán)。氧化可導(dǎo)致堿基裂解,、鏈斷裂和 mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變,。然而，如前所述,，水解似乎被認(rèn)為是驅(qū)動(dòng) mRNA 降解的關(guān)鍵因素,。