LNPs 作為遞送系統(tǒng)

為了克服裸露的mRNA轉(zhuǎn)染的種種問題,，已經(jīng)開發(fā)了保護性遞送系統(tǒng),。目前的mRNA疫苗（表 1）都在使用 LNP 技術(shù),。這說明了使用LNP能在穩(wěn)定mRNA 的同時并將其遞送到細胞中,。mRNA疫苗中的LNP 由四種主要成分組成（見表1）：中性磷脂、膽固醇,、聚乙二醇 (PEG) 脂質(zhì)和可電離脂質(zhì),。可電離脂質(zhì)含有帶正電荷的可電離胺基團（在低 pH 條件下電離）,，可在顆粒形成過程中與陰離子mRNA 相互作用,，并在細胞攝取過程中促進膜融合。此外,，PEG化脂質(zhì)用于控制粒徑并充當空間屏障起穩(wěn)定作用,，防止儲存過程LNP微粒聚集。通過使用微流控混合生產(chǎn)技術(shù),，這些脂質(zhì)成分與 mRNA 一起形成大小約為 60-100 nm 的顆粒,。例如，SARS-CoV-2 候選疫苗nCoVsaRNA和ARCoV的平均粒徑分別為75 nm和89 nm,。

表一：

LNPs與脂質(zhì)體的不同之處在于微粒核中存在脂質(zhì),，來自幾項研究的數(shù)據(jù)表明水也存在于微粒內(nèi)部某些空間。這意味著mRNA即使被包封也可能暴露于水性環(huán)境中,。這種類型的內(nèi)部結(jié)構(gòu),，先前已在未包載和包載siRNA的LNP中被冷凍電鏡所觀察到。類似地,，mRNA-LNPs 的冷凍電鏡結(jié)果也顯示了電子致密核,，勞氏紫（Thionine）對RNA進行染色用于冷凍電鏡對比度增強（見圖2）。

盡管mRNA-LNP 的共同特征是脂質(zhì)核,，但該核的確切結(jié)構(gòu)特征及其對脂質(zhì)成分（摩爾比）和 mRNA 定位的依賴性仍存在爭議（見圖3）,。正如 RiboGreen檢測實驗所確定的那樣，mRNA 肯定位于 LNP 內(nèi)部,。RiboGreen 是一種染料,，當與單鏈 mRNA 結(jié)合時會顯示熒光，但不能進入 LNP,。在 mRNA-LNP 制劑中,，例如mRNA 疫苗的制劑，可與RiboGreen結(jié)合產(chǎn)生熒光的mRNA 比例非常低,，因此,，采用RiboGreen來測定的包封率通常 > 90%。綜上所述,，冷凍電鏡（圖2) 和包封率證據(jù)表明,，mRNA-LNPs形成納米粒子，其中包封了 mRNA,，可免受外部介質(zhì)的影響,，LNPs包封的mRNA的結(jié)構(gòu)有3種模型，這些主要來源于siRNA-LNPs分析（圖3）,。

圖2 mRNA-LNP 的冷凍電鏡圖像顯示具有明顯不同電子密度的“囊泡"結(jié)構(gòu)

圖3 siRNA-LNP 和 mRNA-LNP 結(jié)構(gòu)的推測模型的示意圖 A：多層囊泡,；B：納米結(jié)構(gòu)核；C：均質(zhì)核殼

mRNA疫苗所包封的mRNA會影響終LNP的結(jié)構(gòu)：siRNA 在結(jié)構(gòu)和分子量大小上與 mRNA 有很大不同（表 2）并且N/P（可電離的陽離子脂質(zhì)與核苷酸磷酸鹽）摩爾比不同,，N/P摩爾比分別為3和6（表 1）,。mRNA 至少比 siRNA 大 100 倍，這會影響 LNP 的結(jié)構(gòu),。此外,，有跡象表明 mRNA 位于 LNP 的核，而siRNA 更靠近表面,，mRNA 可以形成“囊泡"（圖 2）,。LNP 囊泡部分的組成是一個有爭議的問題，在這種狀態(tài)時：“mRNA 可以從帶電的脂質(zhì)中解離,，留在充滿溶劑的囊泡隔室中",。

表2  mRNA 和siRNA分子之間的差異

mRNA-LNP不太可能是（圖 3A）的多層囊泡模型。它與mRNA-LNP的 TEM結(jié)果中電子致密核位置不對應。目前,，大多數(shù)研究人員認為 mRNA-LNP 貼近核殼模型（圖3 B和C）,，這意味著納米顆粒具有表面層和無定形的各向同性核。Viger-Gravel等,，使用核磁共振光譜證明LNP結(jié)構(gòu)的兩種類型的是可能的,。

他們描述了一個被陽離子脂質(zhì)包圍（圖3B)的包含水孔的無定形核模型。他們還假設中的脂質(zhì)可以均勻分散,，中間有“小水球"（圖 3C）,。后者（圖3B和C）跟siRNA-LNPs和mRNA-LNPs在實驗觀察到的結(jié)果更吻合。

Arteta等人,，使用冷凍電鏡,、小角 X 射線散射 (SAXS) 和小角度中子散射 (SANS) 測量 mRNA-LNP 結(jié)構(gòu)模型。他們發(fā)現(xiàn)DSPC和PEG化脂質(zhì)以及部分可電離的陽離子脂質(zhì)和膽固醇是位于LNP 的表面,，可電離的陽離子脂質(zhì),、膽固醇（取決于其濃度）、水和 mRNA 的主要部分分布在內(nèi)部,。有趣的是,，他們的研究表明，各向同性LNP 由24%（體積分數(shù)）的水組成,。他們指出 mRNA 位于水柱內(nèi),，水柱被陽離子脂質(zhì)包圍（如圖4所示）。這意味著 mRNA 至少部分暴露于LNP 內(nèi)部的水中,，這可能導致mRNA在非冷凍條件下儲存時不穩(wěn)定,，Sebastiani等人也報道了類似的結(jié)果。

因此,，研究 mRNA 如何與 LNP 中的水和可電離的陽離子脂質(zhì)相互作用是一件很有趣的事,。mRNA 是親水的，它可以通過靜電和氫鍵與可電離的陽離子脂質(zhì)相互作用（通常表觀pKa < 6.5）,。這取決于 LNP 內(nèi)部的pH值,，如果 LNP 外殼對質(zhì)子具有滲透性——這很可能，因為 2-(對甲苯胺基)-6-萘磺酸 (TNS) 和勞氏紫等離子化染料可以進入 LNP ,，那么LNP內(nèi)部的pH值與制劑的其余部分應該相似,，約為7 到 8，這意味著大多數(shù)可電離的陽離子脂質(zhì)將不帶電,。

然而,，由于可電離的陽離子脂質(zhì)堆積在中，它們可能表現(xiàn)出聚電解質(zhì)行為,，導致 Henderson-Hasselbalch 方程的偏差,，即滴定曲線的“拖尾"（脂質(zhì)膜內(nèi)的可電離脂質(zhì)的表觀pKa可能與實際值有較大偏差,，這意味著pKa為6.5左右的可電離脂質(zhì)在脂質(zhì)膜內(nèi)的表觀pKa可能與理論值有1~2個pKa單位的偏差，所以pKa為6.5左右的可電離脂質(zhì)在pH值為7-8之間的脂膜內(nèi)時,，依然有可能絕大部分呈現(xiàn)帶正電的狀態(tài),，注：紅色斜體部分是對一些較復雜概念的進一步解讀，后同）,。此外，mRNA 和可電離的陽離子脂質(zhì)之間的相互作用可能會影響電離行為,。

對于 siRNA,，發(fā)現(xiàn)與可電離陽離子脂質(zhì)存在較弱的靜電相互作用，這表明至少對于 siRNA-LNP 制劑,，內(nèi)部的pH值接近或等于外部的pH值,。對于 mRNA-LNP，尚未進行此類實驗研究,。mRNA 和陽離子脂質(zhì)復合的分子動力學模擬研究證明了脂質(zhì)-脂質(zhì)簇和脂質(zhì)-mRNA 簇的形成,。靜電力和氫鍵都在驅(qū)動陽離子脂質(zhì)和 mRNA 的相互作用。

圖4 mRNA-LNPs中mRNA-水柱的示意圖

Arteta 等人的另一個有趣發(fā)現(xiàn)是他們的mRNA-LNP 的外殼是單層的,。其他研究人員根據(jù)冷凍電鏡（圖 2）或 SANS結(jié)果分析提出,，mRNA-LNPs 的外殼由一個或多個雙層組成。這些相互矛盾的發(fā)現(xiàn)表明,，使用這些技術(shù)評估m(xù)RNA-LNP 殼的性質(zhì)是困難的,，可能存在多種類型的mRNA-LNP 結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)取決于脂質(zhì)的性質(zhì)和mRNA-LNP 的制備方法,。反過來,，不同的結(jié)構(gòu)可能會對不同配方的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響?？傊?，問題仍然在于目前我們尚不清楚 mRNA-LNP 的結(jié)構(gòu)以及包封的mRNA 與各種脂質(zhì)成分之間的相互作用。

對各種 mRNA疫苗成分的分析表明,，它們具有共同特征,，但也存在差異（表 1）。LNP 配方,、修飾核苷的使用,、高GC含量以及常規(guī) mRNA 和 SAM 疫苗之間的長度差異可能會影響這些 mRNA疫苗在儲存過程中的物理和化學穩(wěn)定性。