小鼠心肌成纖維細胞分離模型

       小鼠心肌成纖維細胞的組織來源于實驗動物的正常心臟組織,，心臟是脊椎動物身體中最重要的一個器官,，主要功能是提供壓力，把血液運行至身體各個部分,。心臟的作用是推動血液流動,，向器官、組織提供充足的血流量,，以供應(yīng)氧和各種營養(yǎng)物質(zhì),，并帶走代謝的終產(chǎn)物（如二氧化碳、無機鹽,、尿素和尿酸等）,，使細胞維持正常的代謝和功能。心臟中,，心肌成纖維細胞約占正常心肌組織細胞總數(shù)的60%-70%，是心臟中非心肌細胞的主要組成部分,，廣泛存在于心臟組織中,，包圍心肌細胞，連接心肌細胞間質(zhì),，與缺血性心臟病,、炎癥、肥大,、梗死等病理狀態(tài)密切相關(guān),。細胞生長方式以長梭狀細胞，貼壁培養(yǎng),。

小鼠心肌成纖維細胞分離模型

動物品系：大 小鼠

實驗分組：正常對照組,、模型組,、陽性藥組、受試藥組低,、中,、高三個劑量組

實驗周期：N

建模方法：

1. 小鼠頸椎脫臼處死后，剃除腹胸部的被毛,，放入裝有75%酒精的燒杯中浸泡5min,。

2. 取出小鼠，在無菌環(huán)境下打開胸腔,，取出心臟組織,，注入盛有無菌1×PBS的培養(yǎng)皿中，洗凈組織表面的血液,。

3. 將清洗干凈的心臟組織轉(zhuǎn)入裝有75%酒精的培養(yǎng)皿中浸泡15s以殺死大多數(shù)的心臟被膜細胞,，浸泡完成后立即轉(zhuǎn)入裝有無菌1×PBS的培養(yǎng)皿中震蕩清洗。

4. 清洗完成后,，用剪刀鑷子配合除去主動脈弓和心房組織,，僅保留心室部分，再次用1×PBS清洗去除心室內(nèi)的血液,。

5. 將清洗干凈的心室組織用剪刀減成1mm3大小左右的碎塊,，之后用PBS清洗若干次后按下述兩種方法之一進行后續(xù)操作。

A. 貼塊法

6. 將清洗好的碎塊轉(zhuǎn)入另一培養(yǎng)皿中,，用0.25%胰蛋白酶消化液浸泡組織,，室溫消化3-5 min。

7. 消化完成后,，添加數(shù)毫升FBS終止消化,，之后吸棄液體，加PBS清洗組織塊1伺次后,，用200 ul吸頭將組織塊平均接種于T-25培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)面上,，之后將培養(yǎng)瓶放置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中，靜置2-4h,。

8. 待組織處于略微脫水的狀態(tài)時,，小心添加2ml萬全培養(yǎng)基，添加時注意盡量不要將組織塊沖起,，要使培養(yǎng)基接觸所有的組織塊,。

9. 之后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，一般2-4天后成纖維細胞會從組織塊周圍爬出,，待爬出的細胞有較多數(shù)量時,，可將細胞消化下來，去除組織塊,，轉(zhuǎn)入另一培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),。

B. 消化法

6. 將清洗好的碎塊轉(zhuǎn)入另一離心管中,，加入混合消化液（0.08%胰酶+0.06%Ⅱ型膠原酶）37℃水浴消化8 min后，吸取上層混懸液棄去,。

7. 余下組織加入混合消化液10 ml,，37℃水浴震蕩消化10 min；吸取上層懸液至另一離心管中,，加入適量FBS終止反應(yīng),；剩余沉淀物再加消化液消化3-5次，直至組織塊萬全消化,。

8. 按1∶1加入含血清的培養(yǎng)基,，中止酶反應(yīng)，懸液過200目網(wǎng)篩去除較大的組織塊,。

9. 收集全部中止后的消化液于離心管中,，300g，離心10 min,，棄去上清,，加入培養(yǎng)液重懸細胞后計活細胞數(shù)。

10. 調(diào)整細胞密度以1× 106個/ml 接種入的T-25培養(yǎng)瓶中,，每瓶添加2 ml細胞懸液,。

11. 培養(yǎng)瓶放置于37℃，5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中靜置40min后,，吸棄上清液以去除未貼壁的非成纖維細胞和死細胞,，再添加5 ml萬全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

三 傳代步驟

如果細胞密度達80%-90%,，即可進行傳代培養(yǎng),。

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣,、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次,。

2. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘,，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況,，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺,，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3. 按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基,，輕輕打勻后吸出,，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液,，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻,。

4. 將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中,。

四 復(fù)蘇步驟

將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻,。在1000RPM條件下離心4分鐘,，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻,。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?0cm皿中,，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）,。第二天換液并檢查細胞密度,。

五 凍存步驟

待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存,。下面T25瓶為例：

1. 細胞凍存時,，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶,，細胞變圓脫落后,，加入2ml萬全培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計數(shù)板計數(shù),。 

2. 1000RPM離心5分鐘去掉上清,。用血清重懸浮，加DMSO至最終濃度為10%,。加入DMSO后迅速混勻,，按每1ml的數(shù)量分配到凍存管中，注意凍存管做好標(biāo)識,。本公司按每個凍存管細胞數(shù)目大于1X10^6個細胞凍存,。

3. 將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱,，至少2個小時以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存,。記錄凍存管位置以便下次拿取。