小鼠心肌成纖維細(xì)胞分離模型

       小鼠心肌成纖維細(xì)胞的組織來源于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的正常心臟組織,，心臟是脊椎動(dòng)物身體中最重要的一個(gè)器官,，主要功能是提供壓力，把血液運(yùn)行至身體各個(gè)部分,。心臟的作用是推動(dòng)血液流動(dòng),，向器官,、組織提供充足的血流量，以供應(yīng)氧和各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),，并帶走代謝的終產(chǎn)物（如二氧化碳,、無機(jī)鹽、尿素和尿酸等）,，使細(xì)胞維持正常的代謝和功能。心臟中,，心肌成纖維細(xì)胞約占正常心肌組織細(xì)胞總數(shù)的60%-70%,，是心臟中非心肌細(xì)胞的主要組成部分，廣泛存在于心臟組織中,，包圍心肌細(xì)胞,，連接心肌細(xì)胞間質(zhì),，與缺血性心臟病、炎癥,、肥大,、梗死等病理狀態(tài)密切相關(guān)。細(xì)胞生長(zhǎng)方式以長(zhǎng)梭狀細(xì)胞,，貼壁培養(yǎng),。

小鼠心肌成纖維細(xì)胞分離模型

動(dòng)物品系：大 小鼠

實(shí)驗(yàn)分組：正常對(duì)照組、模型組,、陽性藥組,、受試藥組低、中,、高三個(gè)劑量組

實(shí)驗(yàn)周期：N

建模方法：

1. 小鼠頸椎脫臼處死后,，剃除腹胸部的被毛，放入裝有75%酒精的燒杯中浸泡5min,。

2. 取出小鼠,，在無菌環(huán)境下打開胸腔，取出心臟組織,，注入盛有無菌1×PBS的培養(yǎng)皿中,，洗凈組織表面的血液。

3. 將清洗干凈的心臟組織轉(zhuǎn)入裝有75%酒精的培養(yǎng)皿中浸泡15s以殺死大多數(shù)的心臟被膜細(xì)胞,，浸泡完成后立即轉(zhuǎn)入裝有無菌1×PBS的培養(yǎng)皿中震蕩清洗,。

4. 清洗完成后，用剪刀鑷子配合除去主動(dòng)脈弓和心房組織,，僅保留心室部分,，再次用1×PBS清洗去除心室內(nèi)的血液。

5. 將清洗干凈的心室組織用剪刀減成1mm3大小左右的碎塊,，之后用PBS清洗若干次后按下述兩種方法之一進(jìn)行后續(xù)操作,。

A. 貼塊法

6. 將清洗好的碎塊轉(zhuǎn)入另一培養(yǎng)皿中，用0.25%胰蛋白酶消化液浸泡組織,，室溫消化3-5 min,。

7. 消化完成后，添加數(shù)毫升FBS終止消化,，之后吸棄液體,，加PBS清洗組織塊1伺次后，用200 ul吸頭將組織塊平均接種于T-25培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)面上,，之后將培養(yǎng)瓶放置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中,，靜置2-4h。

8. 待組織處于略微脫水的狀態(tài)時(shí)，小心添加2ml萬全培養(yǎng)基,，添加時(shí)注意盡量不要將組織塊沖起,，要使培養(yǎng)基接觸所有的組織塊。

9. 之后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),，一般2-4天后成纖維細(xì)胞會(huì)從組織塊周圍爬出,，待爬出的細(xì)胞有較多數(shù)量時(shí)，可將細(xì)胞消化下來,，去除組織塊,，轉(zhuǎn)入另一培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

B. 消化法

6. 將清洗好的碎塊轉(zhuǎn)入另一離心管中,，加入混合消化液（0.08%胰酶+0.06%Ⅱ型膠原酶）37℃水浴消化8 min后,，吸取上層混懸液棄去。

7. 余下組織加入混合消化液10 ml,，37℃水浴震蕩消化10 min,；吸取上層懸液至另一離心管中，加入適量FBS終止反應(yīng),；剩余沉淀物再加消化液消化3-5次,，直至組織塊萬全消化。

8. 按1∶1加入含血清的培養(yǎng)基,，中止酶反應(yīng),，懸液過200目網(wǎng)篩去除較大的組織塊。

9. 收集全部中止后的消化液于離心管中,，300g,，離心10 min，棄去上清,，加入培養(yǎng)液重懸細(xì)胞后計(jì)活細(xì)胞數(shù),。

10. 調(diào)整細(xì)胞密度以1× 106個(gè)/ml 接種入的T-25培養(yǎng)瓶中，每瓶添加2 ml細(xì)胞懸液,。

11. 培養(yǎng)瓶放置于37℃,，5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中靜置40min后，吸棄上清液以去除未貼壁的非成纖維細(xì)胞和死細(xì)胞,，再添加5 ml萬全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),。

三 傳代步驟

如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng),。

1. 棄去培養(yǎng)上清,，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次,。

2. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中,，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落,，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化,。

3. 按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基,，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘,，棄去上清液,，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4. 將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中,。

四 復(fù)蘇步驟

將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘,，棄去上清液,，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中,，加入約8ml培養(yǎng)基,，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度,。

五 凍存步驟

待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí),，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例：

1. 細(xì)胞凍存時(shí),，棄去培養(yǎng)基后,，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，細(xì)胞變圓脫落后,，加入2ml萬全培養(yǎng)基終止消化,，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。 

2. 1000RPM離心5分鐘去掉上清,。用血清重懸浮,，加DMSO至最終濃度為10%。加入DMSO后迅速混勻,，按每1ml的數(shù)量分配到凍存管中,，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。本公司按每個(gè)凍存管細(xì)胞數(shù)目大于1X10^6個(gè)細(xì)胞凍存,。

3. 將凍存管置于程序降溫盒中,，放入-80度冰箱，至少2個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存,。記錄凍存管位置以便下次拿取,。