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Tunel染色科研實驗技術(shù)服務(wù)介紹
閱讀：202 發(fā)布時間：2024-9-26Tunel染色
Tunel染色
Tunel染色即原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù),。凋亡細胞的DNA雙鏈斷裂或一條鏈出現(xiàn)缺口，產(chǎn)生一系列3’-OH末端,，在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)作用下,，將脫氧核糖核苷酸和生物素所形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3′末端，從而進行凋亡細胞的檢測,。TUNLE染色是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法,，對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，能準(zhǔn)確的反應(yīng)細胞凋亡最典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征,。
技術(shù)原理
晚期凋亡細胞中染色體DNA雙鏈或單鏈斷裂產(chǎn)生粘性3'-OH末端,，在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)的催化下，將帶有生物素(Biotin)分子的dUTP,，標(biāo)記到DNA的3'-末端,，隨后和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鏈酶親和素Streptavidin(Streptavidin-HRP)結(jié)合，最后通過DAB顯色來顯示凋亡細胞,，從而可以通過普通光學(xué)顯微鏡檢測到凋亡的細胞,，這就是Tunel(TdT-mediateddUTPNick-EndLabeling)法檢測細胞凋亡的原理。
實驗流程
關(guān)鍵實驗步驟
1.充分脫蠟和水化,。脫蠟可以先60oC 20min,，再用使用二甲苯兩次5-10min；而水化用梯度乙醇從高濃度到低濃度浸洗,，這些以便后面的結(jié)合反應(yīng)充分,、均勻；
2.把握好細胞通透的時間,。一般根據(jù)切片的厚薄,，選擇蛋白酶k的孵育時間，常用10-30min,，幾μm切片用短時間,；幾十μm切片用長時間，通過摸索達到既不脫片,，有能夠使后面的酶和抗體進入胞內(nèi),。
3.適當(dāng)延長TUNEL反應(yīng)液的時間,。一般是37oC1h，你也可以根據(jù)你的凋亡損傷程度,，選擇更長的時間,，可長至2h，但要結(jié)合你最終的背景著色,。
4.DAB顯色條件的選擇,。一般DAB反應(yīng)10min左右，結(jié)合鏡下控制背景顏色,，最長不超過30min,；promega公司提供的DAB液（桃紅色），不利于辨認棕褐色,，我不太喜歡,。
5.PBS的充分清洗。在TUNEL反應(yīng)后和酶標(biāo)反應(yīng)后的清洗應(yīng)十分嚴(yán)格,，可增加次數(shù)達5次,，因為這些清洗直接決定最后切片的非特異性著色。
6.內(nèi)源性POD的封閉也十分關(guān)鍵,。對于肝臟,、腎臟等血細胞含量多的組織，我的經(jīng)驗是適當(dāng)延長封閉時間和升高過氧化氫的濃度,，可以達到很好的封閉效果,，且不影響最終的特異性染色。
實驗結(jié)果展示：
1,、洗滌蛋白酶K時,，一定要PBS沖洗3次，如果沖洗不凈會嚴(yán)重干擾后續(xù)的標(biāo)記反應(yīng),；
2,、3%的過氧化氫溶液孵育時間不應(yīng)過長，否則會出現(xiàn)過氧化氫導(dǎo)致的DNA斷裂,，產(chǎn)生假陽性,；
3、滴加Tunel檢測液時,，可利用防蒸發(fā)膜防止其蒸發(fā)影響樣本的生物素標(biāo)記,；配制好的DAB顯色液必須一次性使用完畢，不宜凍存,。
常見問題
無/弱染色,？
烤片溫度過高，推薦56℃-60℃1-2h；
一抗是否適用固定液和石蠟切片,，使用濃度是否過低，孵育是否時間過短等,。
染色過深,？
染色試濃度過高或孵育時間過長；
顯色劑濃度過高或孵育時間過長,。
送樣運輸要求：
1,、石蠟切片常溫、組織由標(biāo)準(zhǔn)的石蠟包埋盒包埋,，石蠟與組織要均勻接合,，不能有裂痕；蠟塊厚度根據(jù)所需切片的數(shù)量而定,，有效厚度至少要超過0.1cm,。盡量提供半年內(nèi)的組織蠟塊，超過半年的蠟塊抗原可能丟失,，做免疫組化可能出現(xiàn)檢測不到蛋白,。
2、冰凍切片-20℃,、固定后細胞爬片4℃,。