關(guān)鍵詞：游離藥物濃度，F(xiàn)ree Concentration,，生物樣本前處理,，生物樣品前處理，平衡透析法,，equilibrium dialysis（ED）,，超濾法，Ultra-filtration（UF）,，快速平衡透析裝置,，RED，血漿蛋白結(jié)合,，Plasma Protein Binding(PPB)
游離藥物濃度（Free Concentration）是指生物樣本（如血漿,、血清、組織液等）中未與蛋白質(zhì)或其他大分子結(jié)合的游離態(tài)藥物,、激素,、代謝物或其他小分子分析物的濃度。由于許多生物活性物質(zhì)在體內(nèi)會(huì)與蛋白質(zhì)（如白蛋白,、α?-酸性糖蛋白,、免疫球蛋白等）結(jié)合，只有游離部分才能發(fā)揮藥理或生理活性,，因此測定游離藥物濃度（Free Concentration）在藥代動(dòng)力學(xué)（PK）,、藥效學(xué)（PD）、臨床監(jiān)測和生物分析樣本前處理過程中具有重要意義,。
一,、游離濃度的前處理技術(shù)
在生物樣本（如血液、尿液,、組織等）中測定游離（未結(jié)合）藥物,、激素或其他分析物的濃度時(shí)，生物樣本前處理步驟需確保目標(biāo)物質(zhì)的游離狀態(tài)不被破壞,，同時(shí)去除干擾物質(zhì),。目前的游離藥物濃度分析生物樣品前處理技術(shù)有平衡透析法（equilibrium dialysis,，ED）、超濾法（Ultra-filtration,，UF）,、超速離心法（Ultracentrifugation，UC）,、凝膠過濾/尺寸排阻色譜（Size-Exclusion Chromatography, SEC）,、固相萃取或免疫親和純化和化學(xué)或酶解處理（結(jié)合型釋放后檢測），但常用的是平衡透析法（equilibrium dialysis,，ED）,、超濾法（Ultra-filtration，UF）和超速離心法（Ultracentrifugation,，UC）,，其中平衡透析法更是游離藥物濃度生物樣品前處理技術(shù)的金標(biāo)準(zhǔn)。
1.1 平衡透析法
平衡透析法（equilibrium dialysis,，ED）是測定生物樣本（如血漿,、血清）中游離藥物、激素或代謝物濃度的金標(biāo)準(zhǔn)方法,，常用于血漿蛋白結(jié)合試驗(yàn)（Plasma Protein Binding, PPB）,，其核心原理是利用半透膜使游離小分子在樣本與緩沖液之間達(dá)到平衡，而大分子結(jié)合物（如蛋白結(jié)合型藥物）因無法透過膜被分離,。
【試驗(yàn)步驟】
1,、樣本準(zhǔn)備：血漿,、血清,、腦脊液或其它基質(zhì)
2、透析裝置：不銹鋼特氟龍板平衡透析裝置（HTD）或快速平衡透析裝置（RED）
3,、膜選擇：纖維素膜
4,、加樣：供體室加入含藥基質(zhì)，受體室加入PBS
5,、孵育：37℃,，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4~24小時(shí)，根據(jù)裝置決定孵育時(shí)間
6,、終止與收集：分別從供體室和受體室取一定體積的溶液,，用LC-MS/MS、HPLC或免疫分析法檢測濃度,。
由上可知,，平衡透析法的關(guān)鍵步驟在于裝置、膜的選擇,、平衡時(shí)間的優(yōu)化等三個(gè)方面,。IPHASE作為體外研究生物試劑的引-領(lǐng)者,，為提供更好的服務(wù)，開發(fā)了普通平衡透析裝置（HTD）和快速平衡透析裝置（RED）兩種,，均配以纖維素膜,，以期滿足不同客戶的多種需求。它們在原理上相似,，但在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),、操作效率、適用性等方面存在差異,，以下為兩者詳細(xì)對比：
參數(shù) | 平衡透析（HTD） | 快速平衡透析（RED） |
平衡時(shí)間 | 12~16小時(shí) | 4-6小時(shí) |
最-低樣本量 | 100~200 uL | 50~100 uL |
準(zhǔn)確性 | 金標(biāo)準(zhǔn) | 金標(biāo)準(zhǔn) |
適用結(jié)合率范圍 | 低至高（游離濃度0.1%~99%） | 中至高（游離濃度＞0.5%更可靠） |
操作便捷性 | 需手動(dòng)組裝,，步驟較多 | 商業(yè)化試劑盒，操作簡便 |
高通量支持 | 是（96孔板） | 是（48孔板） |
簡而言之,，平衡透析法具有高準(zhǔn)確性,、適用于低結(jié)合率物質(zhì)（游離濃度＜1%）、無剪切力干擾及可同時(shí)處理多個(gè)樣本（具有96孔板）等多個(gè)優(yōu)點(diǎn),，但其也同時(shí)具備耗時(shí)長,、樣本需求量大、可能受膜吸附或體積位移影響及緩沖液成分可能影響蛋白結(jié)合等多個(gè)缺點(diǎn),。因此,，客戶需根據(jù)具體試驗(yàn)結(jié)合選擇。
1.2 超濾法
超濾法（Ultrafiltration, UF）的核心原理是通過離心力驅(qū)動(dòng)小分子游離分析物通過超濾膜,，而大分子蛋白及結(jié)合物被截留,。以下是超濾法的全面解析，包括原理,、步驟,、優(yōu)缺點(diǎn)、優(yōu)化策略及與平衡透析的對比,。
【試驗(yàn)步驟】
1,、樣本類型：血漿或血清
2、樣本預(yù)處理：3000×g, 10分鐘,，去除細(xì)胞碎片或纖維蛋白
3,、加樣：將100-200 μL血漿加入超濾離心管
4、離心：37℃ 2000-3000×g, 30分鐘（需優(yōu)化轉(zhuǎn)速和時(shí)間,，避免膜堵塞或結(jié)合物解離）
5,、收集濾液：取濾液（通常10-50 μL）用于檢測（LC-MS/MS、HPLC等）
作為快速經(jīng)濟(jì)測定游離濃度的方法之一,，超濾法具有快速高效,、使用樣本量少、及操作簡便等優(yōu)點(diǎn),，但同樣由于其裝置的影響,，超濾法存在著膜吸附,、剪切力干擾及高結(jié)合藥物靈敏度受限等不可忽視的缺點(diǎn)。因此,，客戶可根據(jù)自己的試驗(yàn)需求選擇前處理技術(shù),，若需快速篩查或樣本量有限，可優(yōu)先選擇超濾法,；若需高精度數(shù)據(jù),，則應(yīng)選擇平衡透析法。
1.3 超速離心法
超速離心法(Ultracentrifugation, UC)是一種基于物理分離的技術(shù),，通過極-高的離心力（通常 >100,000×g）將生物樣本中的游離分析物與結(jié)合型分析物（如蛋白結(jié)合物）分離,。該方法適用于血漿、血清,、腦脊液等樣本中游離藥物,、激素或代謝物的測定。其原理是依據(jù)在超高速離心條件下,，由于分子大小和密度的差異,，大分子（如蛋白質(zhì)、蛋白結(jié)合型分析物）因分子量大,、密度高而沉降到管底,，而游離的小分子（未結(jié)合）則保留在上清液中。
【試驗(yàn)步驟】
1,、樣本類型：血清,、血漿、組織樣本
2,、離心速度：100,000–150,000×g,，速度過低可能導(dǎo)致結(jié)合物沉降不完-全
3、離心時(shí)間：30min-2小時(shí),，時(shí)間過長可能導(dǎo)致游離分子吸附或降解
4,、溫度：4℃（推薦）或室溫,，低溫減少蛋白變性和結(jié)合物解離
5,、離心管類型：聚碳酸酯或超離心專用管，避免使用易吸附分析物的材質(zhì)
6,、收集濾液：小心吸取上清液（避免擾動(dòng)沉淀）,，用于后續(xù)分析（如HPLC、LC-MS/MS）,；
若需測定結(jié)合型分析物,，可溶解沉淀（如用緩沖液或有機(jī)溶劑）后檢測。
超速離心法(Ultracentrifugation, UC)由于其不引入抗體,、吸附劑等物質(zhì),，具有無外源干擾,、適用性強(qiáng)和樣本兼容性強(qiáng)等3種優(yōu)點(diǎn)，但由于其通過高速離心進(jìn)行分離,，亦存在潛在結(jié)合物解離,、樣本損傷多及硬件設(shè)施不滿足試驗(yàn)等問題。因此,，若實(shí)驗(yàn)條件允許,，可結(jié)合超濾或平衡透析進(jìn)行方法驗(yàn)證，確保數(shù)據(jù)可靠性,。
綜上所述,，常見的游離濃度樣本分析前處理技術(shù)包括平衡透析法（equilibrium dialysis，ED）,、超濾法（Ultra-filtration,，UF）和超速離心法（Ultracentrifugation，UC）,，它們有各自的適用范圍和優(yōu)缺點(diǎn),。因此，客戶應(yīng)結(jié)合實(shí)際情況以選擇合適的方法進(jìn)行游離濃度的獲取,。
參數(shù) | 平衡透析（ED） | 超濾（UF） | 超速離心（UC） |
分離原理 | 擴(kuò)散平衡 | 膜截留+離心力驅(qū)動(dòng) | 沉降速度差異 |
速度 | 慢（小時(shí)級） | 快（分鐘級） | 中等（1-2小時(shí)） |
是否干擾平衡 | 幾乎不干擾 | 可能干擾（濃差極化） | 可能干擾（高壓/剪切力） |
樣品量 | 微量（50-200 uL） | 中小量（100-500 uL） | 中大量（0.5-2 mL） |
適用場景 | 科研（結(jié)合常數(shù)測定） | 臨床（快速檢測） | 特殊體系（脂蛋白,、納米顆粒） |
成本 | 低（透析膜成本低） | 中（超濾管一次性） | 高（設(shè)備昂貴） |
二、IPHASE產(chǎn)品
綜上所述,，游離濃度的生物樣本分析前處理主要有平衡透析法,、超濾法和超速離心法等三種方法，作為體外研究生物試劑引-領(lǐng)者,，IPHASE可以給平衡透析前處理提供血漿蛋白結(jié)合試驗(yàn)平衡透析裝置,、一次性快速平衡透析板、可重復(fù)使用快速平衡透析板,、快速平衡透析插件,、平衡透析膜、血漿蛋白結(jié)合試驗(yàn)平衡透析裝置封口膜,、血漿蛋白結(jié)合試驗(yàn)平衡透析裝置底座,、特氟龍板和超濾管等多類產(chǎn)品。
名稱 | 規(guī)格 |
血漿蛋白結(jié)合試驗(yàn)平衡透析裝置 | 24/48/96孔 |
一次性快速平衡透析板 | 1 Plate,48 Wells |
可重復(fù)使用快速平衡透析板 | 1 Plate,48 Wells |
快速平衡透析插件10個(gè),12-14kDa | 10 Inserts,12-14kDa |
快速平衡透析插件10個(gè),8kDa | 10 Inserts,8kDa |
快速平衡透析插件50個(gè),12-14kDa | 50 Inserts,12-14kDa |
快速平衡透析插件50個(gè),8kDa | 50 Inserts,8kDa |
快速平衡透析裝置48插管 | 48 Inserts,12-14kDa |
快速平衡透析裝置48插管 | 48 Inserts,8kDa |
平衡透析膜 | 3.5kd,，12-14kd,，25kd，50kd |
血漿蛋白結(jié)合試驗(yàn)平衡透析裝置封口膜 | 100 Sheets |
特氟龍板 | 96孔-9塊,，24孔-5塊,，48孔-7塊 |
超濾管 | 0.5mL 10 kd/50支 |
血漿蛋白結(jié)合試驗(yàn)平衡透析裝置底座 | 1個(gè) |
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匯智和源，致力于為創(chuàng)新藥研發(fā)企業(yè)及生命科學(xué)研究機(jī)構(gòu)提供高品質(zhì)的生物試劑,，IPHASE為公司核心品牌,，品牌宗旨“Innovative Reagents For Innovative Research",。
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