肝臟作為藥物暴露的主要器官,，在藥物的代謝和毒性過程中起著至關(guān)重要的作用,。原代肝細胞（Primary Hepatocytes）具有完整的細胞特性和生理水平的酶和輔助因子，既包括膜結(jié)合酶【如細胞色素P450（Cytochrome P450）混合功能氧化酶,，為滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的還原酶】,，也包括胞質(zhì)酯酶，擁有肝臟中所有的代謝途徑,。因此,，原代肝細胞（Primary Hepatocytes）被廣泛認為是構(gòu)建體外肝臟模型的金標(biāo)準(zhǔn)，在藥物相互作用,、藥物代謝和藥物毒性研究中受到研究者的青睞,。因此，本文概述了基于原代肝細胞的二維（2D）和三維（3D）培養(yǎng)模型及其在藥物研發(fā)中的運用,。
一,、原代肝細胞分離
大多采用兩步膠原酶灌注法。較小動物可通過門靜脈或下腔靜脈進行肝臟灌注,。較大動物通過肝葉或肝節(jié)段灌注,。成功分離肝細胞的幾個關(guān)鍵因素：第一，無細胞毒性的膠原酶,。第二,，恰當(dāng)?shù)南瘯r機。消化不足和消化過度都會損害肝細胞的產(chǎn)量和活力,。第三,，良好的肝臟狀況。肝細胞對缺血性損傷非常敏感,。用于制備肝細胞的肝臟應(yīng)迅速冷卻,，以降低代謝速率防止代謝性缺氧和隨后的缺血,。分離的原代肝細胞用于藥物研究的標(biāo)準(zhǔn)：1、實驗開始時活率> 80%,，在整個實驗過程中活率下降< 20%,；2、對2-3種已知上市藥物的代謝進行檢測,，與文獻值相當(dāng),；3、誘導(dǎo)實驗中典型誘導(dǎo)劑如利福平應(yīng)使特定酶(CYP3A4)活性增加至少3倍,；4,、代謝和轉(zhuǎn)運體研究中，凍存肝細胞胞接種4-6 h后貼壁率>70%,。
二,、原代肝細胞2D培養(yǎng)
懸浮肝細胞（Suspension Hepatocytes）模型
擁有完整的藥物代謝酶和輔助因子，可用于不同代謝清除途徑的研究,。然而,，懸浮肝細胞(Suspension Hepatocytes)的活率和藥物代謝酶活性隨著體外孵育時間增加會逐漸降低，限制其孵育時間最長為4小時,，一般用于估計中,、高清除速率藥物的清除。當(dāng)清除速率小于20%時,，不能準(zhǔn)確確定清除值,。傳統(tǒng)的懸浮肝細胞體外代謝研究模型不足以使慢代謝化合物產(chǎn)生足夠被檢測到的代謝反應(yīng)，所以在預(yù)測慢代謝化合物的清除率及其代謝產(chǎn)物方面存在局限性,?？刹捎脩腋「渭毎恿Ψ椒ǎ▓D1），孵育時間可延長至20小時甚至更長,。
應(yīng)用：小分子藥的酶活性和代謝穩(wěn)定性研究,。
圖1. 懸浮肝細胞接力法轉(zhuǎn)移流程DRUG METAB DISPOS, 2012,40(9):1860–1865
貼壁肝細胞（Plateable Hepatocytes）模型
原代肝細胞2D培養(yǎng)于膠原蛋白包被的培養(yǎng)物表面。肝細胞呈現(xiàn)上皮形態(tài),，細胞核突出，常呈雙核狀,。單一肝細胞貼壁培養(yǎng)的缺陷：1,、細胞極性和功能發(fā)生改變；2,、缺乏正常功能所需的其它相關(guān)細胞類型(即非實質(zhì)細胞),；3、無法提供足夠的營養(yǎng)和旁分泌因子以支持肝細胞執(zhí)行功能(如膽汁酸和血清蛋白的生物合成),。
應(yīng)用：
★評價藥物-藥物相互作用:包括酶誘導(dǎo),、酶抑制和轉(zhuǎn)運體研究,。首先，當(dāng)藥物作為誘導(dǎo)劑時,，可導(dǎo)致藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運體表達增加,。強效誘導(dǎo)劑可同時上調(diào)多個基因，如苯-巴比-妥誘導(dǎo)CYP2B6,、CYP3A4,、CYP2C9、UGT以及MRP2等多種轉(zhuǎn)運蛋白,。其次,，不同種屬肝細胞對誘導(dǎo)劑反應(yīng)存在差異。如利福平對人和兔肝細胞是一種有效的誘導(dǎo)劑,，但對大鼠肝細胞無誘導(dǎo)作用,。最后，貼壁肝細胞（Plateable Hepatocytes）亞理想的鋪板密度可能導(dǎo)致P450的基礎(chǔ)表達降低,，并人為增加誘導(dǎo)反應(yīng),，如圖3所示，貼壁肝細胞在較小鋪板密度時CYP1A2,、CYP2B6和CYP3A4的基礎(chǔ)活性都較低,，卻有更強的誘導(dǎo)反應(yīng)。因此需要健康,、合適鋪板密度的肝細胞來獲得生理學(xué)相關(guān)的數(shù)據(jù),。
圖2.凍存人肝細胞鋪板密度與酶誘導(dǎo)的關(guān)系Current Drug Discovery Technologies, 2010, 7:188-198
★肝毒性評估：光鏡下觀察細胞形態(tài)、液泡和脂滴的聚集以及細胞的附著/脫落等形態(tài)學(xué)變化,。檢測肝細胞壞死（谷草轉(zhuǎn)氨酶,、乳酸脫氫酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶) 和凋亡（DNA斷裂）。對于細胞因子介導(dǎo)的細胞毒性,，由于受鄰近的非實質(zhì)細胞如Kupffer,、星狀和竇狀內(nèi)皮細胞釋放的物質(zhì)調(diào)控，單一貼壁培養(yǎng)的肝細胞不能預(yù)測毒性反應(yīng),。
★ "接力法"用于慢代謝化合物清除率及其代謝產(chǎn)物研究: 貼壁肝細胞藥物代謝酶活性在貼壁培養(yǎng)24 h 后開始降低,。可將貼壁肝細胞用含待測化合物的無血清培養(yǎng)基孵育24小時后,，收集培養(yǎng)基混合后置于新貼壁培養(yǎng)的肝細胞（圖3）,。
圖3. 貼壁肝細胞接力法轉(zhuǎn)移流程Drug Metabolism Letters, 2016,10: 3-15
★評估靶向肝細胞的小核酸藥的細胞攝取、內(nèi)吞,、內(nèi)體逃逸以及對靶基因的沉默效果,。
三明治培養(yǎng)模型
在體外通過在兩層膠原或Matrigel內(nèi)培養(yǎng)肝細胞可以重構(gòu)體內(nèi)結(jié)構(gòu)，稱為三明治培養(yǎng),。肝細胞培養(yǎng)在兩層凝膠-膠原之間(夾心結(jié)構(gòu)),，可改善肝細胞的形態(tài)和活力,，并在培養(yǎng)中維持較長時間的功能。此外,，三明治式培養(yǎng)的肝細胞可重新恢復(fù)極性,，允許基底外側(cè)和小管轉(zhuǎn)運體
的適當(dāng)定位以及功能性膽管網(wǎng)絡(luò)的形成（圖4）。
圖4.人肝細胞三明治模型中轉(zhuǎn)運蛋白的極化表達Current Drug Discovery Technologies, 2010, 7, 188-198
應(yīng)用：
★估計化合物的膽道排泄,。
★評估內(nèi)源性和外源性化合物和代謝物的肝膽分布,。
★估計代謝和轉(zhuǎn)運體介導(dǎo)的清除，構(gòu)建基于生理學(xué)的藥代動力學(xué)模型,。
★研究肝細胞毒性,，提供臨床藥物性肝損傷的機制。數(shù)據(jù)整合到系統(tǒng)藥理學(xué)模型中預(yù)測人類潛在的藥物性肝損傷,。
三,、原代肝細胞3D培養(yǎng)
球狀體（Spheroid）模型
通過超低粘附培養(yǎng)、懸滴培養(yǎng),、磁化細胞培養(yǎng)等技術(shù)（圖5）,，原代肝細胞可不依賴外部基質(zhì)，聚集形成直徑高達150-175µm的球狀團聚體,。球狀體培養(yǎng)的一個優(yōu)點是,，每個球體只需要1330-2000個細胞，與其它3D培養(yǎng)技術(shù)相比顯著減少,。最近的一項研究表明原代肝細胞球狀體培養(yǎng)可持續(xù)5周,，CYP酶活性在第8天到第35天之間幾乎沒有變化。一項蛋白質(zhì)組分析表明,，與三明治培養(yǎng)相比,，球形培養(yǎng)中負責(zé)藥物吸收、分布,、代謝和排泄的酶能更好地保存14天,。然而，肝臟比細胞團復(fù)雜得多,。肝細胞的基底外側(cè)與血液接觸,，在頂端側(cè)膽汁流出，這是復(fù)雜的肝小葉結(jié)構(gòu)的主要特征,，目前還不能在球狀體模型中復(fù)制,。
應(yīng)用：
★慢代謝化合物清除率及其代謝產(chǎn)物研究。
★肝細胞毒性研究,。
★評估靶向肝細胞的小核酸藥的細胞攝取、內(nèi)吞,、內(nèi)體逃逸以及對靶基因的沉默效果,。
圖5.球狀體培養(yǎng)方法
肝類器官（Liver Organoids）模型
對類器官定義的共識是:來源于干細胞,、祖細胞或分化細胞的3D結(jié)構(gòu)，能夠在體外再現(xiàn)原生組織的某些功能和結(jié)構(gòu),，可有效地再現(xiàn)體內(nèi)微環(huán)境和細胞與細胞之間的相互作用,。肝類器官已被確定為人類肝臟生物學(xué)研究的最-先進模型。
構(gòu)建肝類器官的細胞來源：
多能干細胞(PSCs)：胚胎干細胞(ESCs)和誘導(dǎo)多功能干細胞(iPSCs)具有高多能性,、可塑性和無限增殖能力,，在特定信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子的作用下分化為具有活性和功能的肝細胞樣細胞。然而,，PSCs誘導(dǎo)的肝類器官可能發(fā)生表觀遺傳和遺傳畸變,，在擴增過程中表現(xiàn)出染色體非整倍體改變。
應(yīng)用：
★構(gòu)建遺傳性肝病模型
★構(gòu)建感染性肝病模型
★藥物細胞毒性
★移植和肝臟疾病研究,。
肝組織來源細胞：包括膽管細胞和肝細胞,。成熟肝細胞在特定環(huán)境中仍具有干細胞潛能和增殖能力。與PSCs誘導(dǎo)的類器官相比,，原代組織來源的類器官更成熟,，基因組更穩(wěn)定，在長期體外培養(yǎng)過程中保持了表型和遺傳穩(wěn)定性,。然而,，與胎兒人肝細胞或成年小鼠原代肝細胞相比，成熟人肝細胞類器官的長期增殖能力有限,。到目前為止,，成人肝細胞類器官的培養(yǎng)仍然具有挑戰(zhàn)性。
培養(yǎng)方法（圖6）：肝組織消化成單細胞,，將Matrigel/細胞混合物接種在24孔板中,，以形成圓頂狀結(jié)構(gòu)。細胞培養(yǎng)箱(37℃)中孵育15分鐘,。凝固后加入特定培養(yǎng)基,。大約14天后傳代。7-10天后,，用分化培養(yǎng)基替換原來的培養(yǎng)基,。
應(yīng)用：
★肝毒性模型
★體外代謝紊亂研究。
★非酒精性脂肪肝疾病
★良性和惡性肝病的藥物開發(fā)
圖6. 組織源性肝類器官的培養(yǎng)和傳代過程Cell & Bioscience (2023) 13:197
球狀體培養(yǎng)與類器官培養(yǎng)比較
球狀體 | 類器官 | |
細胞類型 | 成熟肝細胞 | 干細胞,、前體細胞,、成熟肝細胞 |
機理 | 利用成熟細胞自然聚集的傾向來維持其分化 | 重現(xiàn)胚胎發(fā)育或組織再生過程。 |
培養(yǎng)技術(shù) | 阻止細胞粘附的技術(shù) | 基質(zhì)膠 |
培養(yǎng)基 | 無特殊添加劑的普通培養(yǎng)基 | 含分化必需的細胞因子和生長因子培養(yǎng)基 |
細胞分化程度 | 細胞一直處于分化狀態(tài) | 初期較低,，可實現(xiàn)一定程度的分化 |
培養(yǎng)時間 | ≤5周 | ≤11個月 |
四,、原代肝細胞共培養(yǎng)模型
2D原代肝細胞共培養(yǎng)模型
將兩種或兩種以上不同類型的細胞混合在2D培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)。其關(guān)鍵特征在于不同細胞之間的直接相互作用,，細胞和細胞外基質(zhì)的相互作用,，或者通過細胞因子,、化學(xué)通訊間接傳遞信號。原代肝細胞功能（如白蛋白產(chǎn)生和藥物代謝能力）可以維持長達3周,。
★原代肝細胞與成纖維細胞共培養(yǎng)：用于慢代謝化合物清除率及其代謝產(chǎn)物研究,。
★原代肝細胞與非實質(zhì)肝細胞（星狀細胞，肝竇內(nèi)皮細胞）共培養(yǎng)：用于藥物性肝損傷的研究,，有助于研究細胞因子,、趨化因子和生長因子在藥物暴露后調(diào)節(jié)肝臟適應(yīng)性反應(yīng)中的作用。
★原代肝細胞與T細胞共培養(yǎng)：檢測肝藥物代謝特異性T細胞反應(yīng),。
★IPHASE也開發(fā)了不同種屬的原代肝細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)HepatoMaxTM（圖7）,，通過原代肝細胞與基質(zhì)細胞共培養(yǎng)，可以實現(xiàn)人原代肝細胞在3周內(nèi)保持良好的藥物代謝酶活性,，適用于慢代謝化合物清除率及其代謝產(chǎn)物研究,。
圖7. IPHASE人原代肝細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)
3D原代肝細胞共培養(yǎng)模型
直接3D共培養(yǎng)：將兩種或多種不同類型的肝細胞（原代肝細胞、肝竇內(nèi)皮細胞,、肝星狀細胞,、枯否氏細胞）混合成自組裝球體，或在膠原蛋白,、纖維蛋白,、海藻酸鹽和水凝膠等構(gòu)建的3D環(huán)境中共同培養(yǎng)。直接3D共培養(yǎng)可以使不同肝細胞緊密接觸,，通過細胞間直接黏附,、可溶性細胞因子旁分泌、細胞外基質(zhì)黏附等機制實現(xiàn)肝細胞間的信號通信,。
應(yīng)用：
★構(gòu)建肝纖維化模型
★構(gòu)建藥物性肝損傷模型
★評估藥物相互作用,、藥物代謝和酶誘導(dǎo)。
間接三維共培養(yǎng)：采用物理分離系統(tǒng)（Transwell或各種材料）將兩種或兩種以上類型的細胞（如原代肝細胞與NIH/3T3細胞或肝竇內(nèi)皮細胞）在3D環(huán)境中分層培養(yǎng),，物理分離系統(tǒng)兩側(cè)的細胞之間不允許直接接觸,，它們之間的信號通過可溶性細胞因子進行溝通。
應(yīng)用：研究非接觸式肝細胞在體通信,。
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