冷凍保護(hù)劑添加了冷凍保護(hù)劑的凍存液,，一般都是高滲透壓的,。當(dāng)細(xì)胞從生理溶液轉(zhuǎn)移到低溫保存溶液時(shí),，由于胞外溶液中的滲透壓較高，細(xì)胞會(huì)脫水,，同時(shí)低溫保存溶液的小分子擴(kuò)散到細(xì)胞內(nèi)時(shí),，細(xì)胞體積會(huì)緩慢減少；如果冷凍保存液中只有非穿透性冷凍保護(hù)劑(如葡聚糖和蔗糖),，細(xì)胞也會(huì)脫水并保持脫水狀態(tài),，只是冷凍保護(hù)劑不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。在解凍復(fù)蘇階段,，水從細(xì)胞外的低滲溶液迅速移動(dòng)到細(xì)胞內(nèi)的高滲透溶液,，而小分子冷凍保護(hù)劑則向相反的方向緩慢移動(dòng)，導(dǎo)致細(xì)胞體積膨脹,，并達(dá)到細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓恢復(fù)平衡,。所以，在細(xì)胞冷凍處理和解凍復(fù)蘇的過(guò)程中,，稍有差錯(cuò),，細(xì)胞就會(huì)因?yàn)闈B透壓的過(guò)度變化，導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂而死亡,。這就是細(xì)胞的滲透壓力性損傷,。
細(xì)胞凍存和復(fù)蘇采取“慢凍快融”的原則，慢速冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水份滲出細(xì)胞外,，減少細(xì)胞內(nèi)形成冰晶的機(jī)會(huì),，快融以保證細(xì)胞外結(jié)晶快速融化，避免慢速融化水份滲入細(xì)胞內(nèi),，再次形成胞內(nèi)冰晶造成對(duì)細(xì)胞的損傷,。
(一)細(xì)胞凍存
配制含10%DMSO或甘油的細(xì)胞凍存液，4℃預(yù)冷(新鮮配制的凍存液會(huì)產(chǎn)生大量的熱),；
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,，用細(xì)胞消化酶將單層生長(zhǎng)的細(xì)胞消化下來(lái)；懸浮細(xì)胞則直接將細(xì)胞收集到離心管中,；
離心1200rpm,，6 min；
去除上清液,，逐漸加入適量預(yù)冷的細(xì)胞凍存液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻,，計(jì)數(shù),，調(diào)節(jié)凍存液中的細(xì)胞終濃度為5×10e6/ml~1×10e7/ml；
將細(xì)胞分裝入凍存管中,，每管1~1.5ml,；
在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱,、凍存時(shí)間及操作人員姓名；
凍存：標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序?yàn)榻禍厮俾?1~-2℃/min,；到達(dá)-80℃時(shí),，則可迅速放入液氮中。
(二)細(xì)胞復(fù)蘇
佩戴眼鏡和手套,，從液氮中取出凍存的細(xì)胞管,。
迅速放入38℃水浴中，并不時(shí)搖動(dòng),，在1分鐘內(nèi)使其*融化,，然后在無(wú)菌條件下取出細(xì)胞。
1200rpm/min離心5-10min,，棄去上清,，加入適量培養(yǎng)液混勻后接種于培養(yǎng)瓶中，次日更換一次培養(yǎng)液,。
解凍后洗滌是去除冷凍保護(hù)劑最常見(jiàn)的方法,，即對(duì)細(xì)胞進(jìn)行洗滌液或培養(yǎng)液重懸后離心，去除上清液,，然后將細(xì)胞重新懸浮在洗滌液或培養(yǎng)液中,。然而，需要注意的是,，解凍后洗滌會(huì)造成凍存細(xì)胞的數(shù)量損失,。
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