1 概述
1.1 藥物代謝研究簡介
藥物代謝研究是創(chuàng)新藥物研發(fā)的重要內(nèi)容，它不僅決定了創(chuàng)新藥物制劑研發(fā)的成敗,，而且與創(chuàng)新藥物研發(fā)的速度和質(zhì)量有密切關系,。因而，藥物代謝研究在新藥研發(fā)工程中具有*的重要作用,，研究藥物代謝對于了解藥物在體內(nèi)的變化過程至關重要,。
藥物代謝研究的方法主要分為體內(nèi)和體外兩種。體內(nèi)代謝法因藥物在生物體內(nèi)的分布較廣,，加上代謝轉(zhuǎn)化的器官和酶系的多樣性,，使藥物及其代謝產(chǎn)物在體內(nèi)的濃度比較低,，代謝產(chǎn)物的檢測具有一定的困難,。體外代謝法在短時間內(nèi)可以得到大量的代謝產(chǎn)物，且代謝條件可控,，代謝體系比較“干凈",，代謝物易于分離、提取，有利于代謝途徑研究及代謝產(chǎn)物結果的確定等,，因而,，體外代謝法具有突出的*性。
由于肝臟是藥物代謝的主要場所,，體外代謝模型多以肝臟為基礎,。目前，研究體外代謝方法主要有：肝微粒體體外溫孵法,、重組P450酶體外溫孵法,、肝細胞體外溫孵法、肝臟離體灌流法和肝切片法,。其中,，肝微粒體體外溫孵法與其他體外代謝方法相比，酶制備簡單,，代謝過程快,，重現(xiàn)性好，易大量操作,，同時可用于藥物代謝酶的抑制及體外清除等方面的研究,，因而在實際工作中應用較為普遍。
1.2 CYP450酶代謝表型研究的重要性
藥物代謝酶表型鑒定,，主要是研究參與藥物清除的代謝酶的類型,、數(shù)量和相對貢獻率。如果藥物主要通過單一的代謝途徑對藥物進行清除,，可能會存在很大的用藥風險,；相反，如果某一藥物的代謝過程涉及的代謝酶越多,，則說明其代謝途徑也越多,，也就難以發(fā)生潛在的藥物-藥物相互作用，使得患者之間的治療偏差降低,。因此,，在新藥臨床前研究中，對藥物的代謝酶表型進行鑒定,，獲得其主要代謝酶的消除比例,，闡明參與藥物體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化的相關酶亞型，對于研究藥物的代謝機制,，預測藥物代謝多態(tài)性和藥物間相互作用等方面具有重要意義,。
1.3 CYP450酶及代謝表型研究方法
CYP450為一類含亞鐵血紅素蛋白的超家族，根據(jù)相關酶亞型在藥物代謝中的重要程度,，可將CYP450分為以下三類：（1）主要CYP450,，包括CYP1A2,、CYP2C9 、CYP2C19 ,、CYP2D6 和CYP3A4,；（2）較主要CYP450，包括CYP2B6,、CYP2C8和CYP3A5,；（3）次要CYP450，包括CYP1A1,、CYP1B1,、CYP2A6、CYP2E1,、CYP2J2和CYP4A11等,。參與藥物代謝的動物肝微粒體P450酶較為復雜，而人肝微粒體中參與藥物代謝的P450酶相對比較簡單,，主要有CYP1A,、CYP2C、CYP2D,、CYP2E和CYP3A,，其組成見圖1。
圖1 人肝內(nèi)P450酶的組成
目前,，CYP450的酶表型鑒定主要使用以下3種方法：選擇性抑制法,、重組人源CYP450同工酶法、相關性分析法,。選擇性抑制法又分為化學抑制法和抗體抑制法,，即在加入和不加入一系類CYP450酶亞型選擇性化學抑制劑或抗體的條件下，分別測定人肝微粒體對藥物的代謝活性,，以考察人肝微粒體中CYP450酶亞型倍選擇性抑制后,，藥物的代謝是否受到影響，從而計算相對抑制百分率,，推斷CYP450酶代謝表型,。其中，化學抑制法由于其操作簡單,，且價格低廉而得到廣泛應用,。
2 實驗原理
參與藥物代謝的CYP450酶主要為CYP1、CYP2和CYP3三個家族,，其中CYP1A2,、CYP2B6、CYP2C8,、CYP2C9,、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4/5是主要的藥物代謝酶,。CYP2B6和CYP2C19在體外沒有特異性的選擇性抑制可用,，一般還需結合重組酶法進行其表型確定。噻氯匹定是CYP2B6的抑制劑,，諾卡酮是CYP2C19的抑制劑,，α-奈黃酮為CYP1A2的特異的選擇性抑制劑，槲皮素為CYP2C8的特異的選擇性抑制劑,，磺胺苯吡唑為CYP2C9的特異的選擇性抑制劑,，奎尼丁為CYP2D6的特異的選擇性抑制劑，酮康唑為CYP3A4/5的特異的選擇性抑制劑,，如選用特異的選擇性抑制劑抑制不同亞型的酶的活性,，便可通過化學抑制法研究藥物的CYP450酶代謝表型。
3 實驗方法描述
肝微粒體體外溫孵法是采用肝微粒體,，輔以NADPH再生系統(tǒng)（IPHASE匯智和源）,，在體外模擬生理環(huán)境條件進行代謝反應，經(jīng)過一定時間的反應后,，采用HPLC,、LC-MC和LC-MC/MC等測定溫孵液中原型藥物或其代謝產(chǎn)物的濃度，分析其主要代謝途徑,。
3.1 肝微粒體制備
P450酶主要在肝臟中表達,，肝臟中的P450酶在體外是以微粒體的形式存在的。微粒體是指在細胞勻漿和差速離心過程中獲得的由破碎的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自我融合形成的近似球形的膜囊泡狀結構,，是異質(zhì)性的集合體,。它包含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和核糖體兩種基本成分，在體外實驗中具有蛋白質(zhì)合成,、蛋白質(zhì)糖基化和脂類合成等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的基本功能,。目前，制備肝微粒體常用的方法是差速離心法,。具體制備流程見下圖（圖2）：
圖2 肝微粒體制備流程圖
3.2 體外孵育體系的建立
CYP450酶代謝表型研究的肝微粒體體外孵育體系,，是由制備的肝微粒體輔以氧化還原型輔酶，再加入酶特異的選擇性抑制劑,，在模擬生理溫度及生理環(huán)境的條件下進行生化反應的體系,。
推薦使用的孵育體系為：每個孵育體系總體積為200 µL，體系包括0.1M PH 7.4 的磷酸緩沖液,，匯智和源NADPH再生系統(tǒng)（1mM NADP,，5 mM的6-磷酸葡萄糖，1 U/mL 6-磷酸葡萄糖脫氫酶,，3.3 mM的氯化鎂）,；適當濃度的肝微粒體蛋白,；適量的選擇性抑制劑；合適濃度的待測物,，于37°C水浴孵育,，每個樣品平行3次，以不加選擇性抑制劑組為對照,。于預設的反應時間點,，加入等體積預冷的乙腈終止反應。
3.3 原型藥物或代謝產(chǎn)物的檢測
采用HPLC,、LC-MC和LC-MC/MC等測定溫孵液中原型藥物或其代謝產(chǎn)物的濃度,。
例：
下圖（圖3、圖4,、圖5）為研究某一候選藥物的CYP450酶代謝表型的實驗,，該實驗采用選擇性化學抑制劑的方法分析了該藥物在鼠、犬和人肝微粒體中的代謝情況,，從而判斷微粒體中哪些CYP450亞型是該藥物的主要代謝酶,。
數(shù)據(jù)計算：
用待測物的消除速率表示待測物在微粒體孵育體系中的代謝速率。
抑制率%=（1- 加入抑制劑樣品代謝速率/空白對照樣品代謝速率）×100%
圖3 大鼠肝微粒中某藥物的代謝抑制率
圖4 犬肝微粒中某藥物的代謝抑制率
圖5 人肝微粒中某藥物的代謝抑制率
從上圖可知,，不同種屬微粒體中,，該候選藥物的代謝抑制率存在差異。表明,，不同種屬微粒體中參與該候選藥物代謝的酶亞型可能不同,。
4 CYP450酶代謝表型研究試劑盒簡介
本公司針對CYP450酶代謝表型研究的需要，以肝微粒體體外溫孵法為指導,，以化學抑制法為基礎,，開發(fā)了一款專門用于CYP450酶代謝表型研究的試劑盒，該產(chǎn)品可直接用于藥物CYP450酶代謝表型研究,，省去了肝微粒體制備和試劑配制的繁瑣過程,，大大縮短了實驗周期，且試劑盒各組成成分經(jīng)過嚴格的質(zhì)量檢測,，符合CYP450酶代謝表型研究試驗要求,，實驗結果準確、可靠,、重現(xiàn)性好,。
4.1 產(chǎn)品說明
本產(chǎn)品提供了采用化學抑制法進行CYP450酶代謝表型研究的所有試劑，可直接用于藥物CYP450酶代謝表型的研究,，省去了試劑配制的繁瑣過程,，且試劑盒各組成成分經(jīng)過嚴格的質(zhì)量檢測，實驗結果準確、可靠,、重現(xiàn)性好,。
根據(jù)微粒體種屬的不同，可根據(jù)實際需求選擇人肝微粒體,、恒河猴肝微粒體,、比格犬肝微粒體、大鼠肝微粒體和小鼠肝微粒體中的一種,。
4.2 試劑盒優(yōu)勢
便捷——本試劑盒省去了肝微粒體制備和試劑配制時間,，可以直接使用,，大大縮短了實驗周期,。
準確——本試劑盒各成分均經(jīng)過嚴格的質(zhì)量檢測，實驗結果準確,、可靠,、重現(xiàn)性高。
穩(wěn)定——本試劑盒穩(wěn)定性強,、易于運輸和保存,。
4.3 產(chǎn)品組成
50反應/盒，200μL/反應,。
4.4 產(chǎn)品使用說明
4.4.1 試驗組
1）冰浴融化試劑盒各組分,，置于冰上待用；
2）除微粒體外,，將孵育體系其它各組分按照配比混合并吹吸混勻,，于37℃預孵育5min；
3）將以上混合液195μL/管分裝至2.0mL離心管中,，于37℃水浴中保溫,， 5μL/反應加入肝微粒體，吹吸3次混勻于37℃水浴條件下啟動代謝反應,，使用秒表計時,；
4）于設定孵育時間點，向孵育體系中加入終止液終止反應（如預冷乙腈,，預冷乙腈體積：孵育體系體積=1:1）,。
例：200μL孵育體系配制：
注：a.體系中有機溶劑加入量不得大于1%；
b.若實際需要n個孵育體系,，則需配置n＋1個體系,。
4.4.2對照組：
1）陽性底物組：反應體系中不加選擇性抑制劑，并將受試物換為陽性底物,，其它組分加入量不變,，缺少體積用0.1M PBS緩沖液補齊；
2）無抑制劑組：反應體系中不加選擇性抑制劑,，其它組分加入量不變,，缺少體積用0.1M PBS緩沖液補齊,；
無A、B液組：反應體系中不加A液和B液,，其它組分加入量不變,，缺少體積用0.1M PBS緩沖液補齊。
4.4.3結果計算：
采用底物消除法評價試驗結果,，用待測物的消除速率表示待測物在微粒體孵育體系中的代謝速率,；
抑制率%=（1-加入抑制劑樣品代謝速率/無抑制劑組樣品代謝速率）×100%
4.5 使用注意事項
1）試驗開始前，請自行準備2.0mL離心管,、不同規(guī)格槍頭,、37℃水浴鍋等；
2）本產(chǎn)品僅供科研使用,，不能用于人體及動物的治療或臨床診斷,；
3）使用前，需于冰浴條件下解凍并混合均勻,；
4）于-70℃冰箱冷凍保存,，切勿反復凍融；
5）在使用過程中,，也可根據(jù)實際實驗需求調(diào)整試劑盒使用方法和各組分的加入量,；
6）因CYP2B6和CYP2C19在體外沒有絕對特異的抑制劑可用，故結果分析還需結合其它結果進行,，如重組酶法的結果,。
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匯智和源，致力于為創(chuàng)新藥研發(fā)企業(yè)及生命科學研究機構提供高品質(zhì)的生物試劑,，IPHASE為公司核心品牌,，品牌宗旨“Innovative Reagents For Innovative Research"。
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