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體外染色體畸變?cè)囼?yàn)方法及注意事項(xiàng)

體外染色體畸變?cè)囼?yàn)的目的是檢測(cè)培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體結(jié)構(gòu)畸變,。結(jié)構(gòu)畸變可份為染色體型和染色單體型。大多數(shù)化學(xué)致突變物誘導(dǎo)染色單體型突變,，但染色體型突都也可發(fā)生,。多倍體增加表明受試物可導(dǎo)致染色體數(shù)目畸變。但是,，本方法不用于檢測(cè)數(shù)目畸變,。染色體突變和相關(guān)事件可以引起很多人類遺傳性疾病，并且有證據(jù)表明,，引起體胡魔癌基因和抑癌基因改變的染色體突變以及相關(guān)事件,，與人類和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腫瘤發(fā)生有關(guān)。體外柴色體畸變?cè)囼?yàn)可應(yīng)用于已建立的細(xì)胞系,、細(xì)胞株或原代細(xì)胞培養(yǎng),，根據(jù)培養(yǎng)生長(zhǎng)能力,、核型的穩(wěn)定性、染色體數(shù)目、染色體差異以及染色體響變的自發(fā)頻率選擇合適的細(xì)胞,。

北京匯智泰康醫(yī)藥技術(shù)有限公司針對(duì)染色體畸變?cè)囼?yàn)開(kāi)發(fā)染色體畸變?cè)囼?yàn)試劑盒， 本試劑盒省去了陽(yáng)性底物成分準(zhǔn)備,、誘導(dǎo) S9 制備,，可以直接使用，大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期,；試劑盒各成分均經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè),，無(wú)雜菌污染，誘導(dǎo) S9 活性均符合染色體畸變?cè)囼?yàn)要求，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確,、可靠,、重現(xiàn)性高。染色體畸變?cè)囼?yàn)試劑盒應(yīng)用廣泛,，可進(jìn)行食品,、化學(xué)品、農(nóng)藥,、消毒劑,、食品添加劑、藥物殘留,、化妝品,、容器與包裝材料等多個(gè)方面的遺傳毒理學(xué)檢測(cè)。

染色體畸變?cè)囼?yàn)導(dǎo)則

1  規(guī)范性引用文件

OECD. OECD Guidelines for Testing of Chemicals. 473 In vitro Mammalian Test, 1-10. Paris: OECD, Adopted2lst July, 1997.

2  定義

2.1  染色單體型畸變(chromatid-type aberration )

顯示為單個(gè)染色單體斷裂或染色體單體間斷裂或斷裂和重接的染色體結(jié)構(gòu)損傷,。

2.2  染色體型畸變（chromosome-type aberration）

顯示為兩個(gè)染色單體在同一部位斷裂或染色體單體間斷裂或斷裂和重接的染色體結(jié)構(gòu)損傷,。

2.3  內(nèi)復(fù)制 （endore-duplication）

在DNA復(fù)制的S期之后，細(xì)胞核未進(jìn)行有絲分裂就開(kāi)始了另一個(gè)Ｓ期的過(guò)程,。其結(jié)果是染色體有4,、8、16…倍的染色單體,。

2.4  裂隙（gap）

染色體或染色單體損傷的長(zhǎng)度小于一個(gè)染色單體的寬度,，為染色單體的小錯(cuò)誤排列。

2.5  有絲分裂指數(shù)（mitotic index）

    處于有絲分裂M期的細(xì)胞數(shù)占其總細(xì)胞數(shù)的百分?jǐn)?shù),。細(xì)胞增殖程度的指標(biāo),。

2.6  數(shù)目畸變(numerical aberration)

    染色體數(shù)目改變，不同于所用動(dòng)物或細(xì)胞染色體的正常數(shù)目,。

3  原理

體外染色體畸變?cè)囼?yàn)的目的是檢測(cè)培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體結(jié)構(gòu)畸變,。結(jié)構(gòu)畸變可份為染色體型和染色單體型。大多數(shù)化學(xué)致突變物誘導(dǎo)染色單體型突變,，但染色體型突都也可發(fā)生,。多倍體增加表明受試物可導(dǎo)致染色體數(shù)目畸變。但是,，本方法不用于檢測(cè)數(shù)目畸變,。染色體突變和相關(guān)事件可以引起很多人類遺傳性疾病，并且有證據(jù)表明,，引起體胡魔癌基因和抑癌基因改變的染色體突變以及相關(guān)事件,，與人類和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腫瘤發(fā)生有關(guān)。體外柴色體畸變?cè)囼?yàn)可應(yīng)用于已建立的細(xì)胞系,、細(xì)胞株或原代細(xì)胞培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)生長(zhǎng)能力,、核型的穩(wěn)定性,、染色體數(shù)目,、染色體差異以及染色體響變的自發(fā)頻率選擇合適的細(xì)胞。

4  儀器和設(shè)備

   培養(yǎng)箱,、恒溫水浴,、二氧化碳培養(yǎng)箱、壓力蒸汽消毒器,、,、低溫冰箱(-80℃) 或液氮生物容器、普通冰箱,、天平(精密度0.1g和0.0001g),、生物安全柜、離心機(jī),、無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)瓶,，玻璃器皿等。

5  操作方法和程序

5.1  準(zhǔn)備

5.1.1  細(xì)胞

可利用包括人體細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞系,、細(xì)胞株或原代細(xì)胞培養(yǎng),，如中國(guó)倉(cāng)鼠成纖維細(xì)胞、人或其他哺乳動(dòng)物的外周血淋巴細(xì)胞,。

5.1.2  培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

應(yīng)使用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基和培養(yǎng)條件(培養(yǎng)皿,，CO2濃度，溫度和濕度)維持培養(yǎng),。已確立的細(xì)胞系或細(xì)胞株應(yīng)常規(guī)核實(shí)染色體眾數(shù)和檢測(cè)支原體污染,，如有污染則不應(yīng)使用。應(yīng)了解正常的細(xì)胞周期時(shí)間和培養(yǎng)條件,。

5.1.3  培養(yǎng)物準(zhǔn)備

已建立的細(xì)胞系和細(xì)胞株:從貯備的培養(yǎng)物中增殖細(xì)胞,，接種的密度應(yīng)使細(xì)胞在收獲時(shí)未達(dá)到融合，細(xì)胞培養(yǎng)于37C,。

淋巴細(xì)胞:從健康的個(gè)體采得經(jīng)抗凝劑( 如肝素)處理的全血或分離的淋巴細(xì)胞,，加至含促細(xì)胞分裂劑(植物凝集素等)的培養(yǎng)基中，并于37"C培養(yǎng),。

5.1.4  代謝活化

在有或無(wú)適當(dāng)?shù)拇x話化系統(tǒng)條件下,，將細(xì)胞暴露于受試物。常用的代謝話化系統(tǒng)是以酶誘導(dǎo)劑如Aroclorl254或苯巴比安和β-茶黃酮聯(lián)合處理嚙齒類動(dòng)物肝臟制備的去線粒體后組分(S9) 及輔因子系統(tǒng),。S9在培養(yǎng)液中終濃度范圍為1%~10% (體積分?jǐn)?shù)),。代謝活化系統(tǒng)的條件可能取決于受試物的類別。在某些情況下,，需要使用不同濃度的S9,。通過(guò)遺傳工程建立的可表達(dá)特殊活化酶的細(xì)胞系，將使內(nèi)源性活化成為可能。細(xì)胞系的選擇要提供科學(xué)的依據(jù)(如通過(guò)細(xì)胞色素P450同工酶與受試物代謝的相關(guān)性進(jìn)行判斷),。

5.2  試驗(yàn)條件

5.2.1  溶劑/賦形劑

所用溶劑/賦形劑不應(yīng)與受試物發(fā)生化學(xué)反應(yīng),，并且應(yīng)對(duì)細(xì)胞存活率和s9活性無(wú)影響。如果采用不常用的溶劑/賦形劑,，應(yīng)有資料表明其對(duì)細(xì)胞存活率和S9活性無(wú)影響,。推薦采用水作溶劑賦形劑，當(dāng)受試物在水中不穩(wěn)定時(shí),，則所用的有機(jī)溶劑應(yīng)該是無(wú)水的,。可使用分子篩去除水,。

5.2.2  染毒濃度

在決定高濃度時(shí)應(yīng)考慮受試物的細(xì)胞毒性,、在試驗(yàn)系統(tǒng)中的溶解性以及pH或滲透壓的改變。

正式試驗(yàn)中應(yīng)該在有和無(wú)代謝活化條件下,，利用能反映細(xì)胞完整性和細(xì)胞生長(zhǎng)情況的指標(biāo)來(lái)檢測(cè)細(xì)胞毒性和溶解性,，如融合程度、活細(xì)胞計(jì)數(shù)或有絲分裂指數(shù)等,。預(yù)試驗(yàn)有助于確定細(xì)胞毒性和溶解性,。

至少應(yīng)設(shè)置3個(gè)劑量組，在有細(xì)胞毒性時(shí),，濃度范圍應(yīng)包括大細(xì)胞毒性至幾乎無(wú)細(xì)胞毒性,。組間距為(2~)倍。在收獲時(shí),，高濃度組的細(xì)胞融合程度,、細(xì)胞計(jì)數(shù)或有絲分裂指數(shù)均應(yīng)該有顯著降低(大于50%)。有絲分裂指數(shù)只是間接測(cè)定細(xì)胞毒性/細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的方法,，而且依賴于細(xì)胞處理后的時(shí)間,，但是，對(duì)于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物,，其他的毒性測(cè)試方法可能比較繁瑣且不實(shí)用,，有絲分裂指數(shù)就比較適用。細(xì)胞周期動(dòng)力學(xué)資料如平均傳代時(shí)間(average generation time, AGT)可用于作為確定染毒濃度的補(bǔ)充資料,。對(duì)于相對(duì)無(wú)細(xì)胞毒性的化學(xué)物,，高濃度應(yīng)該是5 uL/ml, 5 mg/ml或0.01 mol/L,取低的一種。

無(wú)細(xì)胞毒性且相對(duì)不溶的受試物,，所用的高劑量應(yīng)保證在染毒期末的終培養(yǎng)液中有可見(jiàn)沉淀,。在有些情況下(例如僅在略高于低溶解濃度時(shí)才出現(xiàn)細(xì)胞毒性)，可在多于一個(gè)肉眼可見(jiàn)沉淀的濃度進(jìn)行試驗(yàn),。應(yīng)在染毒開(kāi)始和結(jié)束時(shí)評(píng)價(jià)溶解性,，因?yàn)樵谠囼?yàn)系統(tǒng)中存在細(xì)胞,、S9和血清等，溶解性可能在染毒過(guò)程中發(fā)生改變,。不溶性之后肉眼可見(jiàn)的沉淀,。沉淀不應(yīng)不干擾計(jì)數(shù)結(jié)果。

5.2.3  對(duì)照

每個(gè)試驗(yàn)應(yīng)包括在有和無(wú)代謝活化條件下同時(shí)進(jìn)行的陽(yáng)性和陰性(溶劑/賦形劑)對(duì)照,。在利用代謝活化時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)是需要代謝活化才顯示致突變作用的化學(xué)物,。

陽(yáng)性對(duì)照物(已知的斷裂劑)在暴露水平應(yīng)有超過(guò)本底值的可重復(fù)和測(cè)量的增加,，以證實(shí)試驗(yàn)系統(tǒng)的敏感性。但陽(yáng)性對(duì)照物的濃度不應(yīng)使讀片者立即發(fā)現(xiàn)其為陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)標(biāo)本片,。陽(yáng)性對(duì)照物如表1所示,。

表1  體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)

也可利用其他適當(dāng)?shù)挠眯詫?duì)服物。如有可能,，應(yīng)利用與受試物化學(xué)結(jié)構(gòu)相關(guān)的陽(yáng)性對(duì)照物,。

在每個(gè)收獲時(shí)間都應(yīng)包括相應(yīng)的陰性對(duì)照。陰性對(duì)照在處理培養(yǎng)液中含溶劑/賦形劑,，并以同樣的方法處理培養(yǎng)物,。而且，也應(yīng)該有未染毒對(duì)照,，除非本底對(duì)照資料證明,，所選用的溶劑無(wú)細(xì)胞毒性或致突變作用。

5.3  操作方法

5.3.1  受試物處理

在有和無(wú)代謝活化系統(tǒng)條件下,，以受試物染毒處于增殖期的細(xì)胞,。淋巴細(xì)胞應(yīng)在有絲分裂刺激后的48 h開(kāi)始染毒。

一般對(duì)每個(gè)濃度和陰性/溶劑對(duì)照應(yīng)該用雙份平行培養(yǎng)物,。當(dāng)本底資料可以證明雙份平行培養(yǎng)物之間變異較小時(shí),，對(duì)每個(gè)濃度改用1個(gè)培養(yǎng)物也可以接受。

氣態(tài)或揮發(fā)性物質(zhì)應(yīng)以適當(dāng)?shù)姆椒ㄔ囼?yàn),，如用密閉的培養(yǎng)瓶,。

5.3.2  收獲時(shí)間

在一次試驗(yàn)，細(xì)胞應(yīng)在有和無(wú)代活化條件下染毒3~6h,并在染毒開(kāi)始后約1.5倍的正常細(xì)胞周期時(shí)采樣,。如此方案在有或無(wú)代謝活化時(shí)均為陰性結(jié)果,，應(yīng)再進(jìn)行一次無(wú)代謝活化的試驗(yàn)，適當(dāng)延長(zhǎng)染毒時(shí)間,。某些化學(xué)物在染毒/采樣時(shí)間長(zhǎng)于1.5 倍正常細(xì)胞周期時(shí)更易檢測(cè),。在有代謝活化條件下得到陰性結(jié)果，需要根據(jù)情況予以證實(shí),。如認(rèn)為陰性結(jié)果不必進(jìn)行證實(shí),，應(yīng)提供適當(dāng)理由,。

5.3.3  染色體制備

在收獲前以秋水仙素或秋水仙胺處理細(xì)胞培養(yǎng)物1~3h。各個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物分別收獲和低滲,、固定和染色,，以制備染色體。

5.3.4  染色體分析

包括陽(yáng)性和陰性對(duì)照的所有涂片,，應(yīng)在顯微鏡分析之前獨(dú)立編號(hào),。由于固定過(guò)程通常會(huì)導(dǎo)致處于分裂中期細(xì)胞的同源染色體丟失，因此所計(jì)數(shù)細(xì)胞的著絲粒數(shù)應(yīng)等于細(xì)胞染色體眾數(shù)+2,。每個(gè)濃度組和對(duì)照組至少計(jì)數(shù)200個(gè)分散良好的中期相細(xì)胞(如果可行,，2個(gè)平行培養(yǎng)樣分別計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞)。當(dāng)觀察的畸變數(shù)很高,，計(jì)數(shù)的中期相數(shù)可以減少,。

雖然此試驗(yàn)的目的是檢測(cè)染色體結(jié)構(gòu)畸變，但應(yīng)同時(shí)觀察和記錄多倍體和內(nèi)復(fù)制,。

6  大鼠肝微粒體酶的誘導(dǎo)和S₉的制備

6.1  誘導(dǎo)

泛應(yīng)用的大鼠肝微粒體酶的誘導(dǎo)劑是多氯聯(lián)苯（PCB混合物）,，選擇健康雄性大鼠體重200g左右，一次腹腔注射誘導(dǎo)劑,，劑量為500mg/kg體重,。誘導(dǎo)劑溶于玉米油中，濃度為200mg/mL,。本巴比鈉和β-萘黃酮結(jié)合也可做為誘導(dǎo)劑,。

1.  S₉制備

動(dòng)物誘導(dǎo)后第五日斷頭處死。處死前12h停止飲食,，但可自由飲水,。首先，用75%酒精消毒動(dòng)物皮毛,，剖開(kāi)腹部,。在無(wú)菌條件下，取出肝臟,，去除肝臟的結(jié)締組織,，用冰浴的0.15mol/L氯化家溶液淋洗肝臟，放入盛有0.15mol/L氯化加溶液的燒杯里,。按每克肝臟加入0.15mol/L氯化家溶液3mL,。用電動(dòng)勻漿器制成肝勻漿，再在低溫高速離心機(jī)上,，在4℃條件下,，以9000g離心10min，取其上清液（S₉）分裝于塑料管中,。每管裝2 mL ~3 mL,。儲(chǔ)存于液氮生物容器中或-80℃冰箱中備用,。

上述全部操作均在冰水浴中和無(wú)菌條件下進(jìn)行。制備肝S₉所用一切手術(shù)器械,、器皿等,，均經(jīng)滅菌消毒。S₉制備后,，其活力需經(jīng)診斷性誘變劑進(jìn)行鑒定,。大鼠肝微粒體肝S9制備過(guò)程時(shí)間較久，也可以直接聯(lián)系北京匯智泰康購(gòu)買(mǎi)現(xiàn)有肝微粒體,，肝S9,，NADPH再生系統(tǒng)，UGT孵育系統(tǒng)等產(chǎn)品,。

高7  數(shù)據(jù)和報(bào)告

7.1  數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)單位是細(xì)胞，應(yīng)評(píng)價(jià)有染色體結(jié)構(gòu)畸變細(xì)胞百分率,。對(duì)染毒組和對(duì)照組應(yīng)列出染色體結(jié)構(gòu)畸變的類型及其數(shù)目和頻率,。應(yīng)分別記錄裂除并報(bào)告，但一般不包括在總畸變率中,。

應(yīng)記錄同時(shí)進(jìn)行的所有染毒組和陰性對(duì)照組細(xì)胞毒性結(jié)果,。

應(yīng)提供各個(gè)培養(yǎng)物的資料，并且以表格形式總結(jié)所有的資料,。

對(duì)明確的陽(yáng)性結(jié)果不要求證實(shí),。對(duì)可疑的結(jié)果應(yīng)進(jìn)一步試驗(yàn)， 改變?cè)囼?yàn)條件,。應(yīng)對(duì)陰性結(jié)果進(jìn)行證實(shí),，方法如5.3.2 所述。在進(jìn)一步試驗(yàn)中應(yīng)考慮改變?cè)囼?yàn)參數(shù),，包括改變濃度間距和代謝活化條件,。

7.2  結(jié)果、評(píng)價(jià)和解釋

判斷陽(yáng)性結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)為染色體畸變細(xì)胞數(shù)有濃度相關(guān)性增加和/或在一個(gè)或多個(gè)濃度有可重復(fù)的增加,。應(yīng)首先考慮結(jié)果的生物學(xué)意義,。利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析，以有助于評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果,。但是,，統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性不應(yīng)是確定陽(yáng)性反應(yīng)的-因素。

多倍體的細(xì)胞數(shù)增加可表明受試物能抑制有絲分裂過(guò)程和導(dǎo)致染色體數(shù)目畸變,，內(nèi)復(fù)制的細(xì)胞數(shù)增加可表明受試物抑制細(xì)胞周期進(jìn)展,。

結(jié)果不符合上述標(biāo)準(zhǔn)的受試物，可認(rèn)為在本系統(tǒng)為陰性結(jié)果,。

雖然大多數(shù)試驗(yàn)將得到明確的陽(yáng)性或陰性結(jié)果,，但在極少情況下,，所得到的資料不能對(duì)受試物的致突變性進(jìn)行明確的判斷。經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn),，結(jié)果仍然是可疑的,。

體外染色體略變?cè)囼?yàn)的陽(yáng)性結(jié)果表明受試物能對(duì)培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物體細(xì)胞誘導(dǎo)染色體畸變。陰性結(jié)果表明在試驗(yàn)條件下受試物對(duì)培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物體細(xì)胞不能誘發(fā)染色體畸變,。晴變,。

1. 試驗(yàn)的解釋和評(píng)價(jià)

8.1  體外試驗(yàn)一般需要外源性代謝活化系統(tǒng)的支持。此代謝活化系統(tǒng)不可能*模擬哺乳動(dòng)物體內(nèi)條件,。應(yīng)注意避免假陽(yáng)性結(jié)果的發(fā)生,，這些假陽(yáng)性結(jié)果可能由于pH、培養(yǎng)基滲透壓的改變或高度細(xì)胞毒性所致,。

8.2  本試驗(yàn)用于篩選可能的哺乳動(dòng)物致突變物和致癌物,。本試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性的很多化學(xué)物是哺乳動(dòng)物致癌物；但本試驗(yàn)和致癌性之間并無(wú)很好的相關(guān)性,。相關(guān)性取決于化學(xué)物類別,，已有證據(jù)表明此試驗(yàn)未檢出的致癌物并不是通過(guò)直接損傷DNA的機(jī)制起作用的。

體外染色體畸變?cè)囼?yàn)試劑盒優(yōu)勢(shì)
便捷—— 本試劑盒省去了誘導(dǎo) S9 制備,，陽(yáng)性底物,、秋水仙素的配制和濃度條件摸索的時(shí)間，可以直接使用,，大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期,。 準(zhǔn)確——本試劑盒各成分均經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)，無(wú)雜菌污染,，誘導(dǎo) S9 活性均符合體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)要求,，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠,、重現(xiàn)性高,。
穩(wěn)定—— 本試劑盒穩(wěn)定性強(qiáng)、易于運(yùn)輸和保存,。
試劑盒使用操作流程
1. 實(shí)驗(yàn)器材,、試劑準(zhǔn)備：1640RPMI培養(yǎng)基、牛血清,、青鏈霉素雙抗,、胰蛋白酶消化液、75,，25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶,、,50mL 或 15mL 試管、200μl 和1000μl 槍頭,、0.22μm 濾膜,、注射器,、平皿、二甲基亞砜,、滅菌 蒸餾水等,；
2. 設(shè)置待測(cè)物劑量，配制各劑量無(wú)菌待測(cè)物溶液,；
3. 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,，貼壁生長(zhǎng)良好的CHL細(xì)胞用0.25 %胰蛋白酶（ Trypsin-EDTA）消化處理制成細(xì)胞懸液，5 mL/瓶接種于25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,，于37℃,、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中加濕培養(yǎng)約24 h-48h；
4. 吸去培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液,，加入一定濃度的受試物,、0.05mL S9混合液（不加S9混合液時(shí)，需用培養(yǎng)液補(bǔ)足）以及一定量不含血清的培養(yǎng)液補(bǔ)足至5mL,，于培養(yǎng)箱中處理6h,，換成含有10%牛血清的*培養(yǎng)基。在收獲細(xì)胞前4 h加入細(xì)胞分裂中期阻斷劑秋水仙素溶液（終濃度為0.2 mg/mL）,；
5. 用0.25%的胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞，加入0.075mol/L氯化加溶液進(jìn)行低滲處理,，固定液（甲醇：冰醋酸=3：1）進(jìn)行固定并滴片,，用吉姆薩染液染色，中性樹(shù)膠封片,，并于油鏡下進(jìn)行閱片,，記錄畸變細(xì)胞的坐標(biāo)位置及畸變類型，具體操作方法參照國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行,；
6. 閱片,。

試驗(yàn)設(shè)計(jì)及受試物的特殊處理
1) 劑量設(shè)計(jì) 決定受試物高劑量的原則是受試物對(duì)試驗(yàn)細(xì)胞的毒性和受試物的溶解度。對(duì)于純的化學(xué)物質(zhì),，一般高劑量為 5 mg,，或溶解度允許，或飽和濃度,，或?qū)?/span>細(xì)胞產(chǎn)生小毒性濃度,。對(duì)于毒性很低、攝入量很大的定型產(chǎn)品,，可根據(jù)其溶解度和對(duì)細(xì)菌的毒性采用可能的大劑量,，至少3個(gè)劑量組，每個(gè)劑量應(yīng)做2個(gè)平皿,。
2) 溶劑 溶劑可選用水,、二甲基亞砜或其他溶劑（溶劑劑量應(yīng)限定在毒性劑量以下,。以二甲基亞砜為例，一般不超過(guò)1%）,， 無(wú)論選用什么溶劑均應(yīng)無(wú)誘變性,。
3) 對(duì)照組的設(shè)置 試驗(yàn)應(yīng)同時(shí)設(shè)有陽(yáng)性物對(duì)照組、溶劑對(duì)照組和未處理對(duì)照,，均包括加S9和不加S9兩種情況,。
4) 受試物的特殊處理 若遇特殊受試物作非常規(guī)處理時(shí)應(yīng)在報(bào)告中說(shuō)明。對(duì)以下幾種情況可作如下處理：
a)  食品包裝材料及其制品成分：根據(jù)材料或制品的組成成分,，可分別采取過(guò)篩抽提,、蒸發(fā)殘?jiān)燃夹g(shù)處理。
b)  揮發(fā)性受試物：可采用真空干燥器處理等方法,。
c)  天然植物材料：可按植物化學(xué)方法制備粗制品或純制品,。

常見(jiàn)問(wèn)題及原因分析
1、收獲細(xì)胞較少：貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)到70-80%左右時(shí)開(kāi)始染毒,，人或哺乳動(dòng)物外周血淋巴細(xì)胞,；
2、自發(fā)回變數(shù)顯著高于標(biāo)準(zhǔn) 原因：a. 培養(yǎng)基配制操作過(guò)程中組氨酸,、生物素添加量高,；b.培養(yǎng)皿經(jīng)環(huán)氧乙烷消毒不*或環(huán)氧乙烷有殘留；
3,、陽(yáng)性底物誘變菌落數(shù)偏離標(biāo)準(zhǔn)范圍 原因：a. 陽(yáng)性底物溶解不*或未充分混勻,；b. 陽(yáng)性底物添加量不準(zhǔn)確；c. 試劑盒保存條件不合適或過(guò)期,，陽(yáng)性底物降解或 S9失活,；d. 操作過(guò)程中添加菌液時(shí)頂層培養(yǎng)基溫度過(guò)高；
4,、待測(cè)物誘變菌落數(shù)非常低或沒(méi)有菌落 原因：a. 待測(cè)物或待測(cè)物溶劑對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)有毒性,；b. 試劑盒保存條件不合適或過(guò)期，陽(yáng)性底物降解或 S9 失活,； c. 操作過(guò)程中添加菌液時(shí)頂層培養(yǎng)基溫度過(guò)高,；
5、菌落分布不均勻,，集中偏向一側(cè),。原因： 倒底層或頂層培養(yǎng)基時(shí)平皿未水平放置；
6,、頂層或底層培養(yǎng)基凝固不充分或滑出平皿 原因：a. 頂層或底層培養(yǎng)基中瓊脂粉含量低,；b. 頂層培養(yǎng)基中加入的溶劑或待測(cè)物酸化，導(dǎo)致凝膠不充分；
7,、如何判斷 Ames 實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否為假陽(yáng)性 將經(jīng)受試物和陽(yáng)性對(duì)照物處理的 Ames 菌落進(jìn)行增菌培養(yǎng)后接種于無(wú)組氨酸的培養(yǎng)基上,觀察比較細(xì)菌的生長(zhǎng)情況,。如果經(jīng)受試 物處理的菌株不能生長(zhǎng)在無(wú)組氨酸的培養(yǎng)基中,而經(jīng)陽(yáng)性對(duì)照物處 理的菌株則可以生長(zhǎng)在無(wú)組氨酸的培養(yǎng)基上,則說(shuō)明經(jīng)受試物處理 的菌株沒(méi)有發(fā)生突變，試驗(yàn)中所觀察到的菌落數(shù)增加是假陽(yáng)性,。