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                                                              ? AAV載體的應(yīng)用現(xiàn)狀
基于腺相關(guān)病毒（AAV）的各種血清型載體被*在人類基因治療和基因疫苗接種應(yīng)用中具有高潛力,。在制造AAV載體期間,，不必要的,，不*的顆粒共同產(chǎn)生,。它們?nèi)狈χ亟M病毒基因組，僅由空衣殼蛋白組成,?？找職ぴ黾恿擞糜卺t(yī)學(xué)應(yīng)用的AAV病毒的所需劑量，并且被認(rèn)為引起針對(duì)載體衣殼的免疫反應(yīng),，導(dǎo)致不必要的副作用,。因此，在制造過程中去除空衣殼以及量化制劑中空AAV顆粒含量的能力是任何AAV生產(chǎn)過程的關(guān)鍵要求,。
                                                                     ? 制備AAV載體的常規(guī)方法
 目前用于制備分離空衣殼（CsCl或碘克沙醇梯度）的方法對(duì)于放大是具有挑戰(zhàn)性的并且不適合于大規(guī)模生產(chǎn),。此外，用于檢測(cè)空衣殼的分析方法和全空粒子比的測(cè)定（電子顯微鏡（EM）測(cè)定,，總粒子測(cè)定[ELISA]結(jié)合基因組拷貝滴定[qPCR]）耗費(fèi)時(shí)間和勞動(dòng)力,，受操作者的影響技術(shù)或不提供用于不同血清型AAV的容易獲得的試劑。
                                                                                   ?新突破
本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)介紹了利用微小電荷差異分離全空和空AAV8顆粒的新方法,。通過在BIA Seperations 的CIMmultus™ QA Monolithic column整體柱上使用線性梯度洗脫,，引入了用于分析AAV顆粒的簡(jiǎn)單，快速和可重復(fù)的分析,。該方法成功應(yīng)用于通過兩種不同制造工藝制備的AAV8顆粒,。

材料與方法
通過CsCl梯度離心制備純化的完整和空AAV8載體顆粒的病毒制劑。
通過切向流過濾（TFF）然后通過碘克沙醇梯度進(jìn)行AAV8的替代制備,。

結(jié)果
電子顯微鏡
通過電子顯微鏡分析AAV8制劑制劑中*和空顆粒的存在,。 空殼用箭頭表示（圖1）。


全衣殼和空殼AAV顆粒的色譜分離
 用完整和空AAV8載體顆粒的CsCl梯度制備物進(jìn)行初始結(jié)合 - 洗脫實(shí)驗(yàn),。 線性鹽梯度下的不同保留體積表明可以對(duì)全載體和空載體顆粒進(jìn)行色譜分離（數(shù)據(jù)未顯示）,。
 基于這些結(jié)果，將全粒子和空粒子的混合物應(yīng)用于CIMmultus™ QA Monolithic column整體柱（圖2）,。 將任意體積的75μL空衣殼制劑與1×10 12 GC的含有93.7％完整AAV載體顆粒（通過EM測(cè)量）的制劑混合（圖2）,。

 檢測(cè)到代表空衣殼和完整衣殼的明顯可區(qū)分的峰。 后來的洗脫峰含有> 99％的負(fù)載的全顆粒（通過qPCR測(cè)定）,。 空衣殼的計(jì)算相對(duì)量（根據(jù)測(cè)量的峰面積）為34％（圖2）,。
 然后使用AAV8衣殼的色譜分離來分析不同AAV制劑中的全粒子與空粒子比率。 基于色譜峰積分,，通過CsCl梯度（通過EM測(cè)量的93.7％飽和度）對(duì)AAV制劑的定量導(dǎo)致空 - 滿比率為0.016（1.6％空顆粒）,，而0.067（空顆粒為6.28％） 由EM分析確定（數(shù)據(jù)未顯示）,。

通過替代方法產(chǎn)生的AAV顆粒的色譜分離和定量
 接下來評(píng)估基于CIM QA的分離和定量的適用性，用于替代的AAV制備（通過TFF制備,，隨后是碘克沙醇梯度）,。 將含有相當(dāng)于5×10 12 GC的AAV制劑加載到CIMmultus™ QA Monolithic column上，并用線性梯度洗脫分離,，如色譜圖所示（圖3）,。 與由CsCl制備的AAV相比，加載的AAV顆粒多5倍（圖2）,，這導(dǎo)致洗脫峰變寬。 在20.0分鐘洗脫的次要峰的峰面積與在22.2分鐘洗脫的主峰的積分（圖3）表明空 - 滿比為0.026（2.5％空顆粒）,，與EM獲得的比例很好地一致（ 空 - 滿比率為0.05;空顆粒為4.5％）,。

為了證明該方法對(duì)不同AAV生產(chǎn)過程的適用性，AAV樣品摻入空顆粒制劑,，使用相同的梯度條件注入CIMmultus™ QA Monolithic column（圖4）,。
分離和定量AAV顆粒（TFF和碘克沙醇梯度），加入空衣殼AAV

?結(jié)論：
開發(fā)了一種快速,，可重復(fù)的方法,，用于在CIMmultus™ QA Monolithic column上通過線性梯度洗脫分離和定量空顆粒和全顆粒AAV8載體。 該方案成功地用于兩種不同的AAV制劑,，并且能夠定量空衣殼含量,，這與替代方法一致。 色譜方法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單,，快速,，不依賴于操作員技術(shù)和需要專門的試劑。 相反,，它在單次測(cè)定中提供粒子特征的定量分析,，運(yùn)行時(shí)間為30分鐘。