根據(jù)Wang等人的前期工作（報(bào)道季銨鹽-QAS與NaCl相比能更好地實(shí)現(xiàn)空衣殼和實(shí)衣殼的分離）,，BIA實(shí)驗(yàn)室將四甲基氯化銨（TMAC）和氯化膽堿與NaCl一起進(jìn)行測(cè)試,。此外BIA實(shí)驗(yàn)室也測(cè)試了上述所有鹽在添加MgCl₂后的色譜性能（Mihevec et. Al, 2023）。

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實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

將先前通過陽(yáng)離子交換色譜（CIMmultus^TM SO3）捕獲的AAV2/8血清型樣品在緩沖液A中稀釋,，上樣至CIMac^TM AAV empty/full -0.1分析柱（3.66E + 11 vg/CV）,。

PATfix系統(tǒng)（BIA Separations）用于色譜分析。

檢測(cè)器設(shè)置

• 電導(dǎo)率和pH值

• 吸光度（260nm,，280nm）,，50 mm UV流通池

• 熒光（激發(fā)/發(fā)射：280/348 nm）

• 光散射（角度：90°）

流動(dòng)相

緩沖液A：

• 20 mM BTP + 0/2 mM MgCl₂+ 1% 山梨糖醇 + 0.1% poloxamer pH 9.0

緩沖液B：

• 20 mM BTP + 0/2 mM MgCl₂+ 400 mM NaCl + 1% 山梨糖醇 + 0.1% poloxamer pH 9.0 或

• 20 mM BTP + 0/2 mM MgCl₂+ 450 mM TMAC + 1% 山梨糖醇 + 0.1% poloxamer pH 9.0 或

• 20 mM BTP + 0/2 mM MgCl₂ + 400 mM 氯化膽堿 + 1% 山梨糖醇 + 0.1% poloxamer pH 9.0

緩沖液C：1 M NaOH + 2 M NaCl

緩沖液D：1 M 乙酸銨

方法

用100 柱體積（CV）緩沖液B（洗脫液）進(jìn)行從0%至100%的梯度洗脫。按照指導(dǎo)手冊(cè)的方法進(jìn)行柱平衡和原位清洗（CIP）（使用緩沖液A進(jìn)行2分鐘柱平衡,，再用緩沖液C用于原位清洗1分鐘,，之后使用緩沖液D清洗去除NaOH,。最后使用緩沖液A使電導(dǎo)率和pH值恢復(fù)到緩沖液基線水平）。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方程? = 2 ?_F − ?_E / ?_F + ?_E,，基于熒光計(jì)算峰間分離度:,，其中 t_F和 t_E是保留時(shí)間，w_F 和 w_E 是AAV實(shí)衣殼和空衣殼基線處的峰寬,。根據(jù)熒光信號(hào)也計(jì)算了AAV空衣殼和實(shí)衣殼的百分比（% E和% F）,，一些色譜圖中也對(duì)UV和光散射進(jìn)行了比較。

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結(jié)果

篩選不同的洗脫鹽：

在不添加2 mM MgCl₂情況下,，使用三種不同配方的緩沖液B：每個(gè)色譜圖顯示2至3個(gè)重疊峰,。空衣殼在第一個(gè)和第三個(gè)峰中洗脫分離（使用TMAC和氯化膽堿的緩沖液,，第三個(gè)峰未分離）,，實(shí)衣殼在第二個(gè)峰中洗脫。使用季銨鹽觀察到更高的AAV空/實(shí)衣殼分離度,，但第三個(gè)未分離的峰看起來像實(shí)衣殼峰的延長(zhǎng)拖尾,。

 在添加2 mM MgCl₂情況下，使用三種不同配方的緩沖液B：每個(gè)色譜圖顯示兩個(gè)重疊的峰,。第一個(gè)峰為空衣殼,，第二個(gè)峰為實(shí)衣殼。向緩沖液中添加鎂會(huì)導(dǎo)致分離度降低,，并使所有洗脫鹽的洗脫曲線更統(tǒng)一,。然而，空衣殼峰的響應(yīng)增加并且峰變窄,。
 

 色譜峰積分示例,，主餾分顯示在相應(yīng)的色譜峰中。生成以下色譜圖時(shí)未添加鎂：

 所有測(cè)試鹽（紫外,、熒光和光散射信號(hào)）在有或無 MgCl2 的情況下的色譜疊加圖：

使用NaCl作為洗脫鹽,，有MgCl₂（實(shí)線）/無MgCl₂（虛線）的色譜疊加圖。

不添加Mg可見三個(gè)分離峰,。
 

 使用TMAC作為洗脫鹽,，有MgCl₂（實(shí)線）/無MgCl₂（虛線）的色譜疊加圖,。

如果不添加MgCl₂,，則無法分離第三個(gè)峰。洗脫電導(dǎo)率更高（對(duì)使用NaCl梯度以低電導(dǎo)率洗脫的血清型可能有用）,。
 

 使用氯化膽堿作為洗脫鹽,，有MgCl₂（實(shí)線）/無MgCl₂（虛線）的色譜圖疊加。

如果不添加MgCl₂,，則無法分離第三個(gè)峰,。與TMAC相比曲線相似,，但洗脫電導(dǎo)率更低。
 

 實(shí)驗(yàn)結(jié)果總結(jié)

基于熒光信號(hào)的AAV實(shí)衣殼的

分辨率和百分比
 

 要點(diǎn)：

向緩沖液中添加鎂會(huì)降低分離度,，但會(huì)改善所有洗脫鹽的洗脫曲線,。這意味著只有兩個(gè)峰被分離，左峰是空衣殼AAV,，右峰是實(shí)衣殼AAV,。盡管NaCl分辨率較低，但有氯化鎂時(shí),，如果在兩峰之間的最低信號(hào)處畫垂直線到X軸用作區(qū)分空AAV衣殼和實(shí)AAV衣殼,，則能顯示出與無氯化鎂時(shí)相似的實(shí)衣殼百分比（詳見上圖示例）。

與NaCl相反,，季銨鹽（TMAC,，氯化膽堿）在無氯化鎂時(shí)導(dǎo)致更寬的峰，更高的空/實(shí)衣殼分離度,，并且第三個(gè)空衣殼峰洗脫于峰尾并沒有與實(shí)衣殼峰分離,。然而，添加 MgCl₂時(shí)季銨鹽顯示出比NaCl更好的分離度,。其中一個(gè)可能的原因是它們作為去離液鹽,，可以穩(wěn)定空病毒衣殼和實(shí)病毒衣殼之間的疏水作用。

歡迎嘗試上述的方法,！如果需要幫助,，請(qǐng)與我們?nèi)〉寐?lián)絡(luò)。