iElisa 卡那霉素檢測試劑盒

iElisa 卡那霉素檢測試劑盒

1. 概要 卡那霉素是氨基糖甙類抗生素, 被廣范應用于 動物疾病的治療,，由于其具有神經(jīng)毒性和腎臟毒 性，損害第 8 對腦神經(jīng),，導致前庭和耳蝸損傷，腎 毒性主要表現(xiàn)為近端身曲管損傷,，出現(xiàn)蛋白質(zhì)尿,、 血尿、腎功能減退等,。目前，ELISA 檢測方法作為 卡那霉素殘留檢測的篩選方法已被廣泛使用,。 本試劑盒是應用 ELISA 研發(fā)的新一代藥物殘留 檢測產(chǎn)品,，與儀器分析技術相比具有快速、簡便,、 準確和靈敏度高等特點,操作時間僅需 30 分鐘，能 大限度地減少操作誤差和工作強度,。 2. 原理 本試劑盒采用直接競爭 ELISA 方法,，在酶標板 微孔條上預包被卡那霉素抗體,，樣本中殘留的卡那 霉素將和酶標抗原競爭包被在酶標板上的抗卡那 霉素抗體,，用 TMB 底物顯色，樣本吸光值與殘留 物卡那霉素的含量成負相關,，與標準曲線比較再乘 以其對應的稀釋倍數(shù),，即可得出待檢中卡那霉素的 含量。 3. 試劑盒組成 1) 包被有抗體的96微孔板：1塊（96 孔,，12 條×8 孔） 2) 卡那霉素標準品： 0 、0.2,、0.5,、1.0、3.0ng/ml 1 瓶× 1.0ml 3) KAN酶標抗原： 1 瓶 × 15ml 4) 10× 濃縮洗滌液： 1 瓶 × 50ml 5) 稀釋緩沖液： 1 瓶 × 50ml 6) 顯色底物： 1 瓶 ×13ml 7) 終止液： 1 瓶 × 7ml 8) 試劑盒說明書 9) 稀釋孔板： 1塊（96 孔） 10) 質(zhì)檢報告 4. 需要的儀器,、試劑 1）儀器 —酶標儀 450nm（iElisa 全自動酶標儀或相當者） —微量移液器 20μl～200μl，100μl～1000μl —25ml 錐形瓶或 50ml 離心管 —8 道微量移液器 —酶標板振蕩器 —天平：感量 0.01g 2） 試劑 —蒸餾水 —pH7.4 PBS 溶液 —0.1mol/mL HCl,、0.1 mol/mL NaOH 5 溶液的配制 洗滌液的配制：將濃縮洗滌液用去離子水稀釋 10 倍后使用（1 份濃縮洗滌液加 9 份蒸餾水）,。 6. 樣品處理 6.1 牛奶樣品 1) 取 10 mL 牛奶樣品于 50 mL 離心管中,，4000 r/min 離心去蛋白。 2) 去除上層脂肪,，吸取 20μl 中間層置于 1.5ml 離 心管中,，加入 980μlKAN 稀釋緩沖液，用渦旋 混合器混勻,。 3) 取樣品稀釋液 50μL 于 ELISA 進行檢測。 稀釋倍數(shù)：50 6.2 動物源性食品（豬肉,，豬肝,，牛肉等） 1) 稱取勻漿后的樣品 5g，加入 20mL 樣品提取液 （pH7.4 PBS 溶液）,，搖床振蕩 30min。 2) 靜置 1min,，3000/min 離心 10min,。吸取 50μl 取上清液于 1.5ml 離心管中，加入 450μl KAN 稀釋緩沖液, 用渦旋混合器混勻,。 3) 取樣品稀釋液 50μL 于 ELISA 進行檢測 稀釋倍數(shù)：40 6.3 凍干藥品 取 10mg 樣品,，用 1ml 樣品復溶液復溶樣品，用 0.1 mol/mL HCl 或 0.1 mol/mL NaOH 調(diào)整溶液 pH 值在 6.0-8.0 之間,，取 50μl 檢測,。 稀釋倍數(shù)：1 6.4 血液樣品 取血漿過夜（4℃）, 4000r/min 離心 10 分鐘,， 取上清液，用稀釋緩沖液按 1：19 的比例離心后上清液 （吸取 50μl 過濾液,，加入 950μl 稀釋液緩沖 液）,。 稀釋倍數(shù)：20 7． 酶聯(lián)免疫分析程序 7.1 測定之前注意事項 1) 使用前將所有試劑平衡至室溫（20-25℃）。 2) 使用后迅速將試劑放入 2-8℃冷藏,。 3) 在 ELISA 分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于 洗板的*性,，正確的洗板操作是 ELISA 測定 程序中的要點,。 4) 所有孵育過程應避免陽光直射，并按要求用蓋 板覆蓋住酶標板,。 7.2 測定程序 1) 將足夠標準品和樣品所用數(shù)量的稀釋孔板放 于板架上。 2) 將同等數(shù)量的包被有抗體的微孔板插入另一 板架,，標準品和樣品做兩個平行實驗,，記錄下 標準和樣品的位置。未使用的酶標板用鋁箔袋 封好置 2-8℃冷藏保存,。 3) 分別吸取 75μl 標準品和樣品加至相應的空的 微孔（雙孔）中，然后各加入 75μl 的 KAN 酶 標抗原（可用排槍）,，將移液器調(diào)至 100μl，每 孔混勻 5 次后,，吸取 100μl 混合的溶液,，加入 到包被有抗體的酶標板架中（可用排槍）,，在 37℃溫育 30min（每個標準和樣品必須使用新 的吸頭）。 4) 倒出孔中的液體,，將微孔架倒置在吸水紙上拍 打以保證*除去孔中的液體,，然后每孔加入 250μl 稀釋好的洗滌液洗滌，振蕩后倒出孔中 的液體,，拍干,；重復操作四次，洗板時每次間 隔20s,，洗完后用力在吸水紙上排干,。 5) 每孔加入100μl顯色底物,，37℃避光溫育10min。 6) 每孔加入50μl 終止液,，混勻,。 7) 置于酶標儀中，振蕩混勻,，在450nm處測定吸 光度值（OD值）,，參比波長630nm,。（iElisa全 自動酶標儀可以直接讀出、打印濃度值）,。 8. 結(jié)果判定 1) 所獲得的每個濃度標準溶液和樣本吸光度值 的平均值（B）除以*個標準（0 標準）的吸 光度值（B0）再乘以 100%,，即百分吸光度值。 百分吸光度值（%）＝ B ×100% B0 以卡那霉素準品濃度值（ppb）為 X 軸,，百分 吸光度值為 Y 軸，繪制標準曲線圖,。相對應每一個 樣品的濃度可以從標準曲線上讀出,。也可以用回歸 方程法，計算出樣本溶液濃度,。利用計算機專業(yè)軟 件，更便于大量樣品的快速分析,。 2） 樣品的實際濃度為讀數(shù)結(jié)果乘以相應稀釋倍 數(shù),。 3） 如果測定值超出檢測范圍，樣品提取溶液按一 定的比例用 pH7.4 PBS 進行稀釋,。 9. 注意事項 1) 室溫低于20℃或試劑及標本未回到室溫（20- 25℃）會導致數(shù)值偏低。 2) 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥過久的情況,， 則會出現(xiàn)標準曲線不成線性,，重復性不好的現(xiàn) 象。所以洗板排干后應立即進行下一步操作。 3) 標準物質(zhì)和顯色液對光敏感,，避免直接暴露在 光線下。 4) 混合要均勻,，洗板要*（包括加樣品和標準 液的時候都必需充分混合均勻）,。 5) 反應停止液為強酸性物質(zhì)，避免接觸皮膚,。 6) 不要使用過了有效期的試劑盒，也不要稀釋或 攙雜使用不同生產(chǎn)廠家的試劑盒這樣會引起 靈敏度降低,。 6） 試劑盒的儲存條件是2-8℃,，切勿冷凍。 10. 檢測方法靈敏度,、準確度、精密度 1) 試劑盒靈敏度: 0.2ppb 2) 試劑盒變異系數(shù)：小于 20%,。 3) 試劑盒準確度：回收率范圍在 70％-120％之 間,。