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登寧分享干貨超濾管如何使用
閱讀：2987 發(fā)布時間：2021-10-27蛋白濃縮和換Buffer通常使用的超濾管,，常用Millipore的Amicon-Ultra-15超濾管（MWCO10kD）。也有其它型號的,、不同體積大小和MWCO超濾管可選,，視目的蛋白的分子量與濃縮前體積、濃縮目標(biāo)體積而定,?？芍貜?fù)使用,。
1,、選擇合適的超濾管，主要考慮MWCO和濃縮體積,，通常應(yīng)截留分子量不應(yīng)大于目的蛋白分子量的1/3,，比如目的蛋白分子量為35kDa，就可以選擇10kDa截留分子量的超濾管,。若目的蛋白分子量為10kD左右,，則可以用截留分子量3kD的超濾管。
2,、新買來的超濾是干燥的,，使用前加入MilliQ水，水量*過膜,，冰浴或冰箱里預(yù)冷幾分鐘,。然后將水倒出，即可加入蛋白液,，加入的多少,，以不超過管頂?shù)陌拙€為準(zhǔn)。操作要輕,，加入蛋白液前,，超濾管需要插在冰上預(yù)冷。
3,、平衡,。質(zhì)量和重心二者都要達(dá)到平衡。注意轉(zhuǎn)速和加速度不可太快,，否則直接損壞超濾膜,。開始離心超濾（離心機(jī)預(yù)冷至4度）。膜與轉(zhuǎn)軸的方向根據(jù)說明書調(diào)整（角轉(zhuǎn)離心機(jī)的情況是膜與軸垂直）,。在實際使用中,，一般轉(zhuǎn)速開的比說明書里的要低,，這樣可以延長離心管的使用壽命。
4,、當(dāng)濃縮到剩下1ml時,，【取50ul國產(chǎn)Bradford溶液，加入10ul流穿,，看有沒變藍(lán)色,，以此判斷超濾管是否漏掉蛋白。如果管漏了,，將上層和流穿重新倒入新管中開始超濾,。要精確判斷是否漏管，用5mg/ml的BSA離心10min,，再取流穿,，跑蛋白膠或Bradford粗測】，繼續(xù)加入剩下的蛋白液濃縮（在冰上操作,，防止蛋白受熱）,，直到濃縮液都加完為止。離心過程中注意是否發(fā)生蛋白沉淀,，導(dǎo)致堵管,。若發(fā)生沉淀，要確定沉淀的具體原因,，是蛋白濃度過高還是Buffer不合適,；前者可用多根超濾管同時超濾，降低濃度的辦法解決,，后者的方法是換不同的Buffer,，直到蛋白不發(fā)生沉淀為止。
超濾管
5,、前面幾步用以濃縮蛋白,，如果要換Buffer，在總蛋白液濃縮至1ml左右的時候,，輕輕加入新的Buffer（經(jīng)0.22um超濾膜超濾）,，再濃縮至1ml左右，連續(xù)三次,，濃縮終體積根據(jù)需要的蛋白濃度而定,，一般不多于500ul，也有濃縮至200ul以內(nèi)的情況,。按照每次至少10倍左右的體積濃縮算,，三次達(dá)到1000倍以上，基本上可以達(dá)到換buffer的目的,。
6,、取出蛋白濃縮液的操作在冰上操作,，用黃槍頭（200ul）取，輕輕順著邊緣插入槍頭,，輕輕吹打,、混勻蛋白液，注意不要碰到超濾膜,，然后吸取濃縮液,，每次吸接近200ul，直到吸完,。管底剩下的一點濃縮液不必吸取,，否則難度太大，有可能損壞超濾膜,。加入MilliQ水到超濾管中,，沒過超濾膜，防止膜失水變干,。
離心超濾管
7,、以下是處理超濾管,，重復(fù)利用超濾管的步驟,。
8、倒出超濾管里的水,，用milliQ水輕輕潤洗幾次,，【若管底有可見的蛋白沉淀，可以先加入水,，然后用槍頭吹打,，注意不要碰到膜，吹打至沉淀懸起,，然后倒掉,，不可用自來水猛沖】然后加入0.2M的NaOH溶液，室溫放置20min,，期間平衡超濾管,。再離心10min。倒出殘留的NaOH溶液,，將管芯浸入MilliQ水的燒杯(1或2L)中,放置幾個小時,再換新的水,放置幾個小時,，不斷稀釋NaOH濃度。50ml管和蓋子用自來水洗,，內(nèi)壁再用MilliQ水洗干凈,。
9、取出浸沒的管芯,，加至接近滿的MilliQ水,，50ml管也加滿MilliQ水,，將管芯慢慢放入50ml
離心管，排出部分水,，然后蓋上蓋子,，放4度保存，直到下次使用,。一般來說,，按照上述步驟和注意事項，每根管用三四年不會壞,。
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