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在生產(chǎn)消費(fèi)品時,，有效地清潔生產(chǎn)設(shè)備對質(zhì)量控制來說至關(guān)重要,。清潔工藝的目標(biāo)是降低產(chǎn)品污染的風(fēng)險，有效的清潔工藝可以將風(fēng)險降低到可接受的水平,，以確保產(chǎn)品質(zhì)量,。如果無法衡量和驗(yàn)證清潔工藝的有效性,，就無法了解產(chǎn)品質(zhì)量和消費(fèi)者安全的風(fēng)險。

總有機(jī)碳（TOC）分析是消費(fèi)品生產(chǎn)商廣泛采用的非專屬方法，用于檢測產(chǎn)品,、清潔劑,、以及微生物等污染物的殘留量。

為了證明TOC分析法適用于預(yù)期用途,，我們對設(shè)備清潔之后可能尚存的殘留物進(jìn)行了回收和線性研究,。工廠通常會測試化學(xué)污染物和化合物，但很少用TOC分析法來測試微生物的回收率,。本文旨在探討對于清潔驗(yàn)證和確認(rèn),，TOC分析法能否證明可接受的微生物污染回收率和線性。

我們同科羅拉多大學(xué)博爾德分校合作,，用一整夜時間在胰酶大豆肉湯中培養(yǎng)100毫升枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）,。以4500轉(zhuǎn)/分鐘的速度將最終培養(yǎng)物的十毫升等分試樣離心分離10分鐘，形成細(xì)胞沉淀,。

在每次離心之間,，倒出上面的液體，用渦旋混合方法用10毫升超純水使沉淀細(xì)胞重新懸浮,。重復(fù)此過程7次,。設(shè)計(jì)淋洗循環(huán)以除去細(xì)胞培養(yǎng)基帶來的TOC污染。在第7次淋洗循環(huán)后,，根據(jù)已有的4,6-二氨基-2-苯基吲哚（4,6-diaminidino-2-phenylindole,，DAPI）染色任務(wù)來對細(xì)胞進(jìn)行重新懸浮、稀釋,、計(jì)數(shù)（見圖1）,。

圖 1：枯草芽孢桿菌在細(xì)胞計(jì)數(shù)的熒光顯微鏡成像

確定細(xì)胞密度之后，用Sievers® M9 TOC分析儀測量1 ppm確認(rèn)標(biāo)樣組,，然后進(jìn)行三次細(xì)胞濃度稀釋,。在測量TOC之后，用0.45 μm滅菌過濾器過濾剩余樣品,，除去細(xì)菌（見圖2）,。然后再次測量TOC以確定每個樣品的非細(xì)胞背景TOC（見圖2）。

圖2：枯草芽孢桿菌的過濾過程

表 1：微生物細(xì)胞密度與TOC的相關(guān)性結(jié)果

圖 3：微生物細(xì)胞密度與TOC的線性關(guān)系

在進(jìn)行微生物TOC定量之后,，分別將1毫升的每種細(xì)胞密度溶液放在不銹鋼試樣板上進(jìn)行試樣污染,，然后使試樣干燥。此試樣污染的目的是確定微生TOC相關(guān)結(jié)果的目視檢測限,。圖4是微生物試樣污染圖,。

圖 4：微生物試樣板污染

微生物TOC相關(guān)結(jié)果和試樣污染圖都說明了連續(xù)監(jiān)測已有的清潔工藝有效性的重要性。在理想光線下,，很容易在試樣板上看到最高細(xì)胞密度（5.8E+07細(xì)胞/mL）的污染斑,。而對于較低細(xì)胞密度，即使光線很好,，也很難在試樣板上看到污染斑,。這表明除了強(qiáng)有力的清潔工藝之外，還需要用非目測的方法來測試清潔工藝的有效性,。

根據(jù)收集的數(shù)據(jù),，可以想象用于生產(chǎn)消費(fèi)品的設(shè)備上仍有顯著微生物污染，卻僅憑目視檢查就被投放到生產(chǎn)中,，導(dǎo)致嚴(yán)重后果,。因此必須連續(xù)監(jiān)測已有的清潔工藝的有效性，才能降低產(chǎn)品質(zhì)量風(fēng)險和消費(fèi)者安全風(fēng)險,。

最后,，由于微生物分子組成的不確定性，很難確定微生物溶液的回收率,。本研究根據(jù)先前在確定活性微生物細(xì)胞中的碳含量時的發(fā)現(xiàn),，旨在確定微生物溶液的理論回收率。圖5是理論微生物TOC產(chǎn)出量的計(jì)算過程,?；诿總€細(xì)胞的碳原子參考數(shù)，5.8E+07細(xì)胞/mL的理論TOC濃度為11.6 ppm,。

圖 5：理論微生物 TOC 產(chǎn)出量的維度分析

在本文的實(shí)驗(yàn)中,，測量到5.8E+07細(xì)胞/mL的TO實(shí)際回收值為9.13 ppm，對挑戰(zhàn)性的化合物的回收率為78.7%,，從而證明實(shí)驗(yàn)方法是成功的,。

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2. DAPI Protocol For Fluorescence Imaging Thermo-Fisher Scientific – US

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