PCR是一種新的核酸定量技術(shù),，該技術(shù)是在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上,，加入熒光標(biāo)記的探針或相應(yīng)的熒光染料來實(shí)現(xiàn)其定量功能。其原理是隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行,，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷積累,，熒光信號強(qiáng)度成比例增加；每次循環(huán)后采集熒光強(qiáng)度信號,，通過熒光強(qiáng)度的變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化,，從而得到熒光擴(kuò)增曲線。
隨著臨床醫(yī)學(xué)和生物診斷試劑的發(fā)展,，為滿足臨床需要,，需要開發(fā)一種不需要低溫儲存和運(yùn)輸?shù)臒晒釶CR擴(kuò)增試劑。由于熒光PCR反應(yīng)體系中含有活性酶,、熒光探針等試劑,，需要低溫保存，以免其化學(xué)性質(zhì)發(fā)生變化,，因此需要冷凍干燥,。凍干熒光PCR試劑的主要方法步驟包括：
1、液體準(zhǔn)備,。熒光PCR擴(kuò)增緩沖液,、引物、探針,、酶和凍干保護(hù)劑按配方混合,，凍干保護(hù)劑的選擇非常重要。常見的凍干保護(hù)劑包括糖類,、多元醇,、聚合物、表面活性劑,、氨基酸,、鹽類等,。一種可凍干的保護(hù)劑通常含有一種以上的保護(hù)劑，但也可以組合使用多種保護(hù)劑,。然而,，凍干保護(hù)劑配方的探索是一個(gè)耗時(shí)的過程，也是凍干成功的關(guān)鍵,。
2,、冷凍干燥。準(zhǔn)備好上述可凍干反應(yīng)試劑,，分裝成PCR八管或定制PCR管,，然后放入PCR分子凍干機(jī)，開始整個(gè)凍干過程,。冷凍干燥過程通常分為三個(gè)不同的階段：預(yù)冷凍階段,、初級干燥階段和次級干燥階段。在預(yù)凍階段,，溫度一般在-50～-40℃保持2-3H,。預(yù)凍后，保持凍干機(jī)內(nèi)溫度不變,，開始抽真空至5-10pa,，保持10-20h。升華后,，將凍干機(jī)內(nèi)部溫度升至-35~-25℃并在真空下保持1-2h,，然后繼續(xù)將凍干機(jī)內(nèi)部溫度升至-5~5℃并保持1-真空下2h,。最后,，在真空下繼續(xù)將凍干機(jī)內(nèi)部溫度升至25-35℃，保持10-12h,。凍干后可通入氮?dú)?，然后按下塞子即可完成整個(gè)凍干操作。凍干法制備的熒光PCR試劑可在室溫避光保存,。它性質(zhì)穩(wěn)定,，易于運(yùn)輸和使用。使用時(shí)只需加入溶解液或稀釋劑即可,。
PCR分子凍干機(jī)采用不銹鋼板設(shè)計(jì),，保證箱體表面光潔度，從而保證無菌要求,。所設(shè)計(jì)的板層強(qiáng)度高,，可保證在長期使用過程中對壓蓋無滲漏、變形和影響,。板層通過機(jī)械加工可以保證對平整度要求高,，平整度好,，凍干箱板層溫度均勻性好。板層控制溫度-55～70℃,，控制溫度范圍寬,，加熱和冷卻溫度可控，效率高,。冷阱的極限溫度≤-85℃,，可對-50以上的任何共晶點(diǎn)進(jìn)行凍干，適用范圍廣,，對低共晶點(diǎn)溫度的分子試劑更安全,。
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