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real-time PCR

熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)步驟：

1,、總RNA抽提（槍頭和離心管均經(jīng)過濕熱滅菌,，無RNA酶）

1）取勻漿器，加入1ml的Trizol Reagent,，置冰上預(yù)冷,。

2）取100mg組織,，加入到勻漿器中。

3）充分研磨直至無可見組織塊,。

4）13000g離心10min取上清,。

5）加入250 μl，顛倒離心管15s,，充分混勻,，靜置3min。

6）4℃下13000g離心8min,。

7）將上清轉(zhuǎn)移到一新的離心管中,，加入0.8倍體積的異丙醇，顛倒混勻,。

8）-20℃放置15min,。

9）4℃下13000g離心10min，管底的白色沉淀即為RNA,。

10）吸除液體,，加入75%乙醇1.5ml洗滌沉淀。

11）4℃下13000g離心5min,。

12）將液體吸除干凈,，將離心管置于超凈臺上吹3min。

13）加入20μl無RNA酶的水溶解RNA,。

14）55℃孵育5min,。

2、反轉(zhuǎn)錄（槍頭和PCR均經(jīng)過濕熱滅菌,，無RNA酶）

1）取一PCR管,，加入含2μg RNA的溶液。

2）加入1μl oligo(dT)15,。

3）用無核糖核酸酶的去離子水補(bǔ)足至12μl,。

4）于PCR儀上70℃保溫5min，迅速置冰上冷卻,。

5）依次加入4μl 5×buffer,，2μl 10mM dNTPs，1μl RNA inhibitor和1μl 反轉(zhuǎn)錄酶,，用槍抽吸混勻,。

6）于PCR儀上42℃保溫60min，結(jié)束后80℃保溫5min滅活反轉(zhuǎn)錄酶,。

3,、定量PCR1）取0.2ml PCR管，配制如下反應(yīng)體系,，每個反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配制3管,。2× qPCR Mix 12.5μl7.5μM基因引物 2.0μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2.5μlddH2O 8.0μl2）取0.2ml PCR管,，配制如下反應(yīng)體系，每個反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配制3管,。2×qPCR Mix 12.5μl7.5μM內(nèi)參引物 2.0μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2.5μlddH2O 8.0μl3）PCR擴(kuò)增預(yù)變性 95℃,，10min循環(huán)（40次） 95℃，15s→60℃,，60s溶解曲線 75℃→95℃,，每20s升溫1℃4、結(jié)果處理ΔΔCT法：A=CT(目的基因,，待測樣本)- CT(內(nèi)標(biāo)基因，待測樣本)B=CT(目的基因,，對照樣本)- CT(內(nèi)標(biāo)基因,，對照樣本)K=A-B表達(dá)倍數(shù)=2-K

real-time PCR