原位雜交（綠色熒光單標(biāo)）

一.項(xiàng)目介紹：

1. 原位雜交原理：原位雜交是指將特定標(biāo)記的已知順序核酸為探針與細(xì)胞或組織切片中核酸進(jìn)行雜交,，從而對(duì)特定核酸順序進(jìn)行定量定位的過(guò)程。原位雜交可以在細(xì)胞標(biāo)本或組織標(biāo)本上進(jìn)行,。

2. 所需器材：

脫水機(jī)G-JT12s,，包.埋機(jī)G-L5/p5,病理切片機(jī)RM2016，凍臺(tái)G-P1,，烤箱GFL-70/230,組織攤片機(jī)G-KDP,，載玻片及蓋玻片，正置熒光顯微鏡,，成像系統(tǒng)，恒溫箱,，高壓滅菌鍋,，移液槍，鐘擺搖床,。

3. 主要試劑：DEPC,。原位雜交固定液。PBS緩沖液,。20×SSC洗脫液,。蛋白酶K。DAPI,?？篃晒獯銣绶馄瑒ｋs交液,。

 二.石蠟切片熒光探針原位雜交實(shí)驗(yàn)步驟

1,、組織固定：組織取出洗凈后立即放入固定液（DEPC水配制）中固定2-12h。

2,、脫水：組織固定完成后經(jīng)梯度酒精脫水后浸蠟,，包埋。

3,、切片：石蠟經(jīng)切片機(jī)切片,，攤片機(jī)撈片，62°烤箱烤片2h,。

4,、石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-無(wú)水乙醇Ⅰ5min-無(wú)水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-DEPC水洗。

5,、消化：根據(jù)組織固定時(shí)間長(zhǎng)短,，切片于修復(fù)液中煮沸10-15分鐘,，自然冷卻。后基因筆畫(huà)圈,，根據(jù)不同組織不同指標(biāo)特性,，滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37°消化    min。純水沖洗后PBS洗3次×5min,。

6,、預(yù)雜交：滴加預(yù)雜交液，37°C孵育1h,。

7,、雜交：傾去預(yù)雜交液，滴加含探針     雜交液, 濃度    ,，恒溫箱     度雜交過(guò)夜,。

8、雜交后洗滌：洗去雜交液,，2×SSC,，37°C 洗10min，1×SSC,，37°C洗2×5min,，0.5×SSC室溫洗10min。若非特異雜交體較多,，可以增加甲酰胺洗滌,。

9、DAPI復(fù)染核：切片滴加DAPI染液,，避光孵育8min,，沖洗后滴加抗熒光淬滅封片劑封片。

10.鏡檢拍照：切片于尼康正置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像,。（紫外激發(fā)波長(zhǎng)330-380nm,，發(fā)射波長(zhǎng)420nm,發(fā)藍(lán)光；FAM(488)綠光激發(fā)波長(zhǎng)465-495nm,，發(fā)射波長(zhǎng)515-555 nm,，發(fā)綠光；CY3紅光激發(fā)波長(zhǎng)510-560,，發(fā)射波長(zhǎng)590nm,，發(fā)紅光。）DAPI染核,，為藍(lán)光,。

注意事項(xiàng)：

1.mRNA為檢測(cè)對(duì)象時(shí)，需嚴(yán)格要求實(shí)驗(yàn)環(huán)境經(jīng)無(wú)RNA酶處理。

2.FISH切片保存時(shí)間較短,，應(yīng)盡快取圖,。

原位雜交（綠色熒光單標(biāo)）

上海茁彩生物科技有限公司,可以承接諸多病理實(shí)驗(yàn)，樣本不僅含有基礎(chǔ)的動(dòng)物組織切片,，還包括植物葉片,、動(dòng)物細(xì)胞、骨片,、腦片,、皮膚等特殊樣本。染色種類多,，染色方法全.石蠟染色,，冰切染色均可操作,同時(shí)還可以承接整體實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目,細(xì)胞實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目,包括樣本的造模,細(xì)胞的培養(yǎng),以及后續(xù)細(xì)胞的增殖、細(xì)胞粘附,、細(xì)胞劃痕等實(shí)驗(yàn).