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免疫熒光（IF）,，是應(yīng)用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理,，通過熒光標(biāo)記抗體對(duì)組織細(xì)胞內(nèi)抗原進(jìn)行定位、定性及定量的研究,。目前科沿有道主要可以對(duì)石蠟切片、冰凍切片,、細(xì)胞爬片,、組織芯片進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)?？蒲赜械滥壳耙淹黄苽鹘y(tǒng)的免疫熒光雙標(biāo)限制，開發(fā)出多色免疫熒光技術(shù),。

實(shí)驗(yàn)流程：

冰凍切片免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟

1,、 冰凍切片固定：冰凍切片從冰箱拿出來復(fù)溫,，晾干水分，冷丙酮固定10min,，待丙酮干后于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次,，每次5min,。

2、 抗原修復(fù)：組織切片置于盛滿EDTA抗原修復(fù)緩沖液（PH8.0）的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù),。中低火5min，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā),，切勿干片,。自然冷卻后將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min,。（修復(fù)液和修復(fù)強(qiáng)度根據(jù)組織來確定）

3、 BSA封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止抗體流走），在圈內(nèi)滴加用3%BSA均勻覆蓋組織,，室溫封閉30min。

4,、 加一抗：輕輕甩掉封閉液,，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內(nèi)4°C孵育過夜,。（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）

5,、 加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min,。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min,。

6,、 DAPI復(fù)染細(xì)胞核：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min,。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min,。

7,、 封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min,。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

8,、 鏡檢拍照：切片于尼康倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像,。（紫外激發(fā)波長330-380nm，發(fā)射波長420nm,；FITC綠光激發(fā)波長465-495nm,，發(fā)射波長515-555 nm；CY3紅光激發(fā)波長510-560,，發(fā)射波長590nm）

石蠟切片免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟

1,、 石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-蒸餾水洗。

2,、 抗原修復(fù)：組織切片置于盛滿EDTA抗原修復(fù)緩沖液（PH9.0）的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)。中火至沸后斷電間隔10min中低火至沸,，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā),，切勿干片,。自然冷卻后將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次,，每次5min。(修復(fù)液和修復(fù)條件根據(jù)組織來確定）

3,、 BSA封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止抗體流走）,，在圈內(nèi)滴加用3%BSA均勻覆蓋組織，室溫封閉30min,。

4,、 加一抗：輕輕甩掉封閉液,，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內(nèi)4°C孵育過夜,。（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）

5,、 加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次,，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的二抗覆蓋組織,，避光室溫孵育50min,。

6、 DAPI復(fù)染細(xì)胞核：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次,，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染液,，避光室溫孵育10min,。

7,、 封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min,。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片,。

8、 鏡檢拍照：切片于尼康倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像,。（紫外激發(fā)波長330-380nm，發(fā)射波長420nm,；FITC綠光激發(fā)波長465-495nm,，發(fā)射波長515-555 nm,；CY3紅光激發(fā)波長510-560，發(fā)射波長590nm）