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eppendorf pcr儀反應(yīng)體系與反應(yīng)條件 標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系： 10×擴(kuò)增緩沖液   10ul 4種dNTP混合物   各200umol/L 引物        各10～100pmol 模板DNA       0.1～2ug Taq DNA聚合酶   2.5u Mg2+       1.5mmol/L 加雙或三蒸水至   100ul PCR反應(yīng)五要素： 參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶,、dNTP,、模板和Mg2+ 引物： 引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度,。
 理論上,，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物,，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增,。
  設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則： ①引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右,。
  ②引物擴(kuò)增跨度： 以200-500bp為宜,，特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段。
  ③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜,，G+C太少擴(kuò)增效果不佳,，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。
ATGC好隨機(jī)分布,，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列,。
  ④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ),，特別是3’端的互補(bǔ),，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶,。
  ⑤引物3’端的堿基,，特別是末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì),，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗,。
  ⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列好有適宜的酶切位點(diǎn),，這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處,。
  ⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。
  引物量： 每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol,，以低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好,，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì),。
  酶及其濃度 目前有兩種Taq DNA聚合酶供應(yīng),， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶,。
 催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U(指總反應(yīng)體積為100ul時(shí)),，濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少,。
  dNTP的質(zhì)量與濃度 dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系,，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性,。
dNTP溶液呈酸性,，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris,。
HCL的緩沖液將其PH調(diào)節(jié)到7.0～7.5,，小量分裝， -20℃冰凍保存,。
 多次凍融會(huì)使dNTP降解,。
 在PCR反應(yīng)中,，dNTP應(yīng)為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制),，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)(偏高或偏低),，就會(huì)引起錯(cuò)配。
 濃度過低又會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量,。
dNTP能與Mg2+結(jié)合,，使游離的Mg2+濃度降低。
  模板(靶基因)核酸 模板核酸的量與純化程度,，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一,，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標(biāo)本。
SDS的主要功能是： 溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì),，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜,，并解離細(xì)胞中的核蛋白，SDS 還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀,；蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì),，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白，再用有機(jī)溶劑酚與抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份,，用乙醇或異丙醇沉淀 核酸,。
 提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。
 一般臨床檢測標(biāo)本,，可采用快速簡便的方法溶解細(xì)胞,，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離,，直接 用于PCR擴(kuò)增,。
RNA模板提取一般采用異胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA,。
  Mg2+濃度 Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響,，在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時(shí),，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜,。
Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低,，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增,，濃度過低會(huì)降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少,。

eppendorf pcr儀 - 工作原理,；
類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物,。
PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)  聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)間后,，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離,，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合,，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備,；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右,，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下,，以dNTP為反應(yīng)原料,，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理,，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程,，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板,。
 每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘,，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。

eppendorf pcr儀熒光化學(xué)
熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)可分為兩種：熒光探針和熒光染料,。
 現(xiàn)將其原理簡述如下：
1）熒光探針：PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針,，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán),。
 探針完整時(shí),，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí),，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解,，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào),，即每擴(kuò)增一條DNA鏈,，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步,。

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