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eppendorfpcr儀反應體系與反應條件　　標準的PCR反應體系：　　10×擴增緩沖液 10ul　　4種dNTP混合物 各200umol/L　　引物 各10～100pmol　　模板DNA 0.1～2ug　　Taq DNA聚合酶 2.5u　　Mg2+ 1.5mmol/L　　加雙或三蒸水至 100ul　　PCR反應五要素： 參加PCR反應的物質主要有五種即引物,、酶,、dNTP,、模板和Mg2+　　引物： 引物是PCR特異性反應的關鍵,，PCR 產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度,。
理論上,，只要知道任何一段模板DNA序列,，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物,，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。
　　設計引物應遵循以下原則：　?、僖镩L度： 15-30bp，常用為20bp左右。
　?、谝飻U增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。
　?、垡飰A基：G+C含量以40-60%為宜,，G+C太少擴增效果不佳,，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶,。
ATGC好隨機分布,，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
　?、鼙苊庖飪炔砍霈F(xiàn)二級結構，避免兩條引物間互補,，特別是3’端的互補,，否則會形成引物二聚體，產生非特異的擴增條帶,。
　?、菀?’端的堿基，特別是末及倒數(shù)第二個堿基,，應嚴格要求配對,，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。
　?、抟镏杏谢蚰芗由虾线m的酶切位點,，被擴增的靶序列好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處,。
　?、咭锏奶禺愋裕阂飸c核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性,。
　　引物量： 每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以低引物量產生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增,，且可增加引物之間形成二聚體的機會。
　　酶及其濃度 目前有兩種Taq DNA聚合酶供應,， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶,，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。
催化一典型的PCR反應約需酶量2.5U(指總反應體積為100ul時),，濃度過高可引起非特異性擴增,，濃度過低則合成產物量減少,。
　　dNTP的質量與濃度 dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關系,，dNTP粉呈顆粒狀,，如保存不當易變性失去生物學活性。
dNTP溶液呈酸性,，使用時應配成高濃度后,，以1M NaOH或1M Tris,。
HCL的緩沖液將其PH調節(jié)到7.0～7.5,，小量分裝,， -20℃冰凍保存,。
多次凍融會使dNTP降解。
在PCR反應中，dNTP應為50～200umol/L,，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制),，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配,。
濃度過低又會降低PCR產物的產量,。
dNTP能與Mg2+結合,，使游離的Mg2+濃度降低,。
　　模板(靶基因)核酸 模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關鍵環(huán)節(jié)之一,，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標本,。
SDS的主要功能是： 溶解細胞膜上的脂類與蛋白質，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜,，并解離細胞中的核蛋白,，SDS 還能與蛋白質結合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白質,，特別是與DNA結合的組蛋白,，再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀 核酸,。
提取的核酸即可作為模板用于PCR反應,。
一般臨床檢測標本，可采用快速簡便的方法溶解細胞,，裂解病原體,，消化除去染色體的蛋白質使靶基因游離，直接 用于PCR擴增,。
RNA模板提取一般采用異胍或蛋白酶K法,，要防止RNase降解RNA。
　　Mg2+濃度 Mg2+對PCR擴增的特異性和產量有顯著的影響,，在一般的PCR反應中,，各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜,。
Mg2+濃度過高,，反應特異性降低，出現(xiàn)非特異擴增,，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性,，使反應產物減少。
eppendorfpcr儀 - 工作原理,；
類似于DNA的天然復制過程,，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。
PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時 聚合酶鏈式反應間后,，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備,；②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后,，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合,；③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下,，以dNTP為反應原料，靶序列為模板,，按堿基配對與半保留復制原理,，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈重復循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈",，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板,。
每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍,。
eppendorfpcr儀熒光化學
熒光定量PCR所使用的熒光化學可分為兩種：熒光探針和熒光染料。
現(xiàn)將其原理簡述如下：
1）熒光探針：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針,，該探針為一寡核苷酸,，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。
探針完整時,，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收,；PCR擴增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解,，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離,，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈,，就有一個熒光分子形成,，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產物形成*同步。