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美國Bio-Rad伯樂pcr儀常見問題
一般為48 h以內(nèi)，有些于當(dāng)日電泳檢測,，大于48 h后帶型不規(guī)則甚致消失,。
假陰性,，不出現(xiàn)擴增條帶
PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有：
①模板核酸的制備,；
②引物的質(zhì)量與特異性,；
③酶的質(zhì)量；
④PCR循環(huán)條件,。

尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究,。
1.  模板：
①模板中含有雜蛋白質(zhì)；
②模板中含有Taq酶抑制劑,；
③模板中蛋白質(zhì)沒有消 化除凈,，特別是染色體中的組蛋白；
④在提取制備模板時丟失過多,，或吸入酚,；
⑤模板核酸變性不*,。在酶和引物質(zhì)量好時，不出現(xiàn)擴增帶,，極有可能是標(biāo)本的消化處理,，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液,，其程序亦應(yīng) 固定不宜隨意更改。
2.  酶失活：需更換新酶,，或新舊兩種酶同時使用,，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠,。
3.  引物：引物質(zhì)量,、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱,，是PCR失敗或擴增條帶不 理想,、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題,，兩條引物一條濃度 高,，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增,，對策為：
①選定一個好的引物合成單 位,。
②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳,，一定要有 引物條帶出現(xiàn),，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶,，一條引物無條 帶,，此時做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決,。如一條引物亮度高,，一條 亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度,。
③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存,，防止多次凍融 或長期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效,。
④引物設(shè)計不合理,，如引物長度不 夠，引物之間形成二聚體等,。

4.  Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大,，濃度過高可降低PCR擴增的特 異性,，濃度過低則影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。

5.  反應(yīng)體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20 ul,、30 ul,、50 ul?；?00 ul,，應(yīng)用多 大體積進行PCR擴增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定,，在做小體積如20 ul 后,，再做大體積時，一定要模索條件,，否則容易失敗,。
 
6.  物理原因：變性對PCR擴增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低,，變性時間短,，極有可能出 現(xiàn)假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影 響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴增效率,。有時還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計,，檢測一下 擴增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度,，這也是PCR失敗的原因之一,。
 
7.  靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合,，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列,，其PCR擴增是不會成功的。
 
假陽性
出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致,，有時其條帶更整齊,，亮度更高。
1.  引物設(shè)計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性,，因而在進行PCR擴增 時,，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,，容易出現(xiàn)假陽 性,。需重新設(shè)計引物。
 
2.  靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交 叉污染,，導(dǎo)致假陽性,。這種假陽性可用以下方法解決：
①操作時應(yīng)小心輕柔，防止 將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外,。
②除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外,，所有試劑或 器材均應(yīng)高壓消毒,。所用離心管及樣進槍頭等均應(yīng)一次性使用。
③必要時,，在加標(biāo)本 前,，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸,。二是空氣中的小片段核酸污 染,，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性,?？苫ハ嗥唇樱c引物互補后,，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生,，可用巢式PCR方法來減輕或消除,。
 
出現(xiàn)非特異性擴增帶
PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小,，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶 與非特異性擴增帶,。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不*互補,、 或引物聚合形成二聚體,。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低,，及PCR循環(huán)次數(shù) 過多有關(guān),。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶 則不出現(xiàn),，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增,。其對策有：
①必要時重新設(shè)計引 物。
②減低酶量或調(diào)換另一來源的酶,。
③降低引物量,，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次 數(shù),。
④適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點法(93 ℃變性,，65 ℃左右退火與延伸)。

出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶
PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶,。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差,，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高,，退火溫度過低,，循環(huán)次數(shù)過多引起,。其對策有：
①減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶,。
②減少dNTP的濃度,。
③適當(dāng)降低Mg2+濃 度。
④增加模板量,，減少循環(huán)次數(shù),。

克隆PCR產(chǎn)物的優(yōu)條件是什么？
插入片段：載體比需實驗確定,。1：1（插入片段：載體）常為比,，摩爾數(shù)比1：8或8：1也行。應(yīng)測定比值范圍,。連接用5 ul 2X連接液, 50 ng質(zhì)粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶,，插入片段共10 ul。室溫保溫1小時,，或4 ℃過夜,。在這2種溫度下，缺T-凸出端的載體會自連,，產(chǎn)生藍斑,。室溫保溫1小時能滿足大多數(shù)克隆要求，為提高連接效率,，需4 ℃過夜,。
 
PCR產(chǎn)物是否需要用凝膠純化？
如凝膠分析擴增產(chǎn)物只有一條帶,，不需要用凝膠純化,。如可見其他雜帶，可能是積累了大量引物的二聚體,。少量的引物二聚體的摩爾數(shù)也很高,，這會產(chǎn)生高比例的帶有引物二聚體的克隆，而非目的插入片段,。為此需在克隆前做凝膠純化,。
 

如果沒有回收到目的片段，還需要作什么對照實驗
（A）涂布未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞,。如有菌落,，表明氨芐失效，或污染上帶有氨芐抗型的質(zhì)粒,，或產(chǎn)生氨芐抗型的菌落,。
 
（B）轉(zhuǎn)化完整質(zhì)粒，計算菌落生長數(shù)，測定轉(zhuǎn)化效率,。例如,，將1 ug/ul質(zhì)粒1:100稀釋,1 ul用于100 ul感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化。用SOC稀釋到1000 ul后,，用100 ul鋪板,。培養(yǎng)過夜，產(chǎn)生1000個菌落,。轉(zhuǎn)化率為： 產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板DNA的總量,。鋪板DNA的總量是轉(zhuǎn)化反應(yīng)所用的量除以稀釋倍數(shù)。具體而言轉(zhuǎn)化用10 ng DNA,，用SOC稀釋到1000 ul后含10 ng DNA,，用1/10鋪板，共用1 ng DNA,。轉(zhuǎn)化率為：1000克隆X10（3次方） ng /鋪板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug轉(zhuǎn)化pGEM-T應(yīng)用10（8次方）cfu/ ug感受態(tài)細胞如沒有菌落或少有菌落,，感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化率太低。

（C）如用pGEM-T正對照,，或PCR產(chǎn)物,，產(chǎn)生>20-40藍斑（用步驟10（8次方）cfu/ ug感受態(tài)細胞），表明載體失去T,。可能是連接酶污染了核酸酶,。T4 DNA連接酶（M1801,，M1804，M1794）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)好無核酸酶污染,，不應(yīng)用其它來源的T4 DNA連接酶替換,。

（D）用pGEM-T或pGEM-T Easy載體，連接pGEM-T正對照,，轉(zhuǎn)化高頻率感受態(tài)細胞（10（8次方）cfu/ug）,按照實驗步驟,，可得100個菌落，其中60%應(yīng)為白斑,，如產(chǎn)生>20-40藍斑, 沒有菌落或少有菌落,，連接有問題。

對照實驗結(jié)果好,，卻沒有回收到目的片段,，實驗出了什么問題？

（A）連接用室溫保溫1小時,，能滿足大多數(shù)克隆,，為提高效率，需4 ℃過夜,。

 
（B）插入片段帶有污染,，使3`-T缺失,，或抑制連接，抑制轉(zhuǎn)化,。為此,，將插入片段和pGEM-T正對照混合，再連接,。如降低了對照的菌落數(shù),，插入片段需純化，或重新制備,。如產(chǎn)生大量的藍斑,，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy載體3`-T缺失,。
 
（C）插入片段不適于連接,。用凝膠純化的插入片段，因受UV過度照射,，時有發(fā)生,。UV過度照射會產(chǎn)生嘧啶二聚體，不利于連接,，DNA必需重新純化,。

（D）帶有修復(fù)功能的耐熱DNA聚合酶的擴增產(chǎn)物末端無A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy載體克隆所需,。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A,。詳情查pGEM-T pGEM-T Easy載體技術(shù)資料（TM042）。

（E）高度重復(fù)序列可能會不穩(wěn)定,，在擴增中產(chǎn)生缺失和重排,，如發(fā)現(xiàn)插入片段高頻率地產(chǎn)生缺失和重排，需用重組缺陷大腸桿菌菌株,，如SURE細胞