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細(xì)胞破碎技術(shù)簡述-超聲波破碎和高壓均質(zhì)技術(shù)應(yīng)用
細(xì)胞破碎,，細(xì)胞破碎技術(shù)是指利用外力破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)容物包括目的產(chǎn)物成分釋放出來的技術(shù),。細(xì)胞破碎分離提純某一種蛋白質(zhì)時(shí),，首先要把蛋白質(zhì)從組織或細(xì)胞中釋放出來并保持原來的天然狀態(tài)，不喪失活性,。所以要采用適當(dāng)?shù)姆椒▽⒔M織和細(xì)胞破碎,。不同的生物體或同一生物體的不同部位的組織，其細(xì)胞破碎的難易不一,，使用的方法也不相同，如動物臟器的細(xì)胞膜較脆弱,，容易破碎,，植物和微生物由于具有較堅(jiān)固的纖維素、半纖維素組成的細(xì)胞壁,。
1. 簡介
2. 原理與技術(shù)
3. 空穴效應(yīng)
4. 撞擊效應(yīng)
5. 剪切效應(yīng)
6. 應(yīng)用介紹
6.1.? 細(xì)胞破碎（大腸桿菌,，酵母菌，細(xì)菌等）
6.2.? 保持細(xì)胞活性
6.3.? 細(xì)菌
6.4.? 酵母菌
6.5.? 真菌
6.6? 植物細(xì)胞
7. 細(xì)胞破碎技術(shù)及常用方法
7.1. 機(jī)械法
7.2.非機(jī)械法
? 簡介
細(xì)胞破碎技術(shù)是指利用外力破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)容物包括目的產(chǎn)物成分釋放出來的技術(shù),，是分離純化細(xì)胞內(nèi)合成的非分泌型生化物質(zhì)（產(chǎn)品）的基礎(chǔ),。 結(jié)合重組DNA技術(shù)和組織培養(yǎng)技術(shù)上的重大進(jìn)展，蛋白質(zhì)可以大規(guī)模生產(chǎn),。
? 原理與技術(shù)
超聲波破碎法利用超聲波振蕩器發(fā)射的15-25kHz的超聲波探頭處理細(xì)胞懸浮液,。 超聲波振蕩器有不同的類型，常用的為電聲型,，它是由發(fā)生器和換能器組成,，發(fā)生器能產(chǎn)生高頻電流，換能器的作用是把電磁振蕩轉(zhuǎn)換成機(jī)械振動,。超聲波振蕩器以可分為槽式和探頭直接插入介質(zhì)兩種型式,。
高壓均質(zhì)機(jī)是由一個(gè)高壓柱塞泵及特殊結(jié)構(gòu)的均質(zhì)閥組成，需處理的物料在柱塞所造成的高壓條件下進(jìn)入可調(diào)節(jié)壓力大小的閥組中,，失壓后的物料從可調(diào)節(jié)限流縫隙中以*的流速（1000米/秒,，可達(dá)1500米/秒）噴出，撞在閥組件之一的沖擊環(huán)上,。
空穴效應(yīng)
被柱塞壓縮的物料內(nèi)積聚了*的能量,，通過可調(diào)節(jié)限流縫隙時(shí)瞬間失壓，造成高能釋放引起空穴爆炸,，致使物料強(qiáng)烈粉碎細(xì)化,。（主要應(yīng)用于均質(zhì)）
撞擊效應(yīng)
通過可調(diào)節(jié)限流縫隙的物料以上述*的速度，撞擊到用特殊材料制成的的沖擊環(huán)上,，造成物料粉碎,。（主要應(yīng)用于細(xì)胞破碎）
剪切效應(yīng)
高速物料通過泵腔內(nèi)通道和閥口狹縫時(shí)會產(chǎn)生剪切效應(yīng)。被三種效應(yīng)處理過的物料可均勻細(xì)化到0.03μm-2μm粒徑,。（主要應(yīng)用于乳化）
? 應(yīng)用介紹
細(xì)胞破碎（大腸桿菌,，酵母菌，細(xì)菌等）
利用大腸桿菌,、酵母等菌種進(jìn)行發(fā)酵,，然后經(jīng)過破壁后提取細(xì)胞內(nèi)酶、蛋白質(zhì)等活性的產(chǎn)物是生物工程中的重要技術(shù),。而這些工藝中很重要的一步就是細(xì)胞破碎,。
保持細(xì)胞活性
保持細(xì)胞活性的重要參數(shù)是溫度和時(shí)間，物料在高壓均質(zhì)閥內(nèi)部的約0.01秒的瞬間,，在高壓的作用下溫度會上升到大約10～15℃,。
通過均質(zhì)閥后在經(jīng)過換熱器的作用下，溫度在2~3秒作用會迅速下降,，所以物料在溫度相對較高的條件下僅僅維持3秒鐘,。
細(xì)菌
幾乎所有細(xì)菌的細(xì)胞壁都是由肽聚糖（peptidoglycan）組成,，它是難溶性的聚糖鏈（glycan chain），借助短肽交聯(lián)而成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),，包圍在細(xì)胞周圍,，使細(xì)胞具有一定的形狀和強(qiáng)度。短肽一般由四或五個(gè)胺基酸組成,，如L-丙氨醯-D-谷氨醯-L-賴氨醯-D-丙氨酸,。而且短肽中常有D-胺基酸與二氨基庚二酸存在。 破碎細(xì)菌的主要阻力是來自于肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),，其網(wǎng)結(jié)構(gòu)的致密程度和強(qiáng)度取決于聚糖鏈上所存在的肽鍵的數(shù)量和其交聯(lián)的程度,，如果交聯(lián)程度大。
酵母菌
酵母細(xì)胞壁的里層是由葡聚糖的細(xì)纖維組成,，它構(gòu)成了細(xì)胞壁的剛性骨架,，使細(xì)胞具有一定的形狀，覆蓋在細(xì)纖維上面的是一層糖蛋白,，zui外層是甘露聚糖,，由1,6一磷酸二酯鍵共價(jià)連接，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),。在該層的內(nèi)部,，有甘露聚糖-酶的復(fù)合物，它可以共價(jià)連接到網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上,，也可以不連接,。與細(xì)菌細(xì)胞壁一樣，破碎酵母細(xì)胞壁的阻力主要決定于壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)的緊密程度和它的厚度,。
真菌
霉菌的細(xì)胞壁主要存在三種聚合物,，葡聚糖（主要以β-1,3糖苷鍵連接，某些以β-1,6糖苷鍵連接）,，幾丁質(zhì)（以微纖維狀態(tài)存在）以及糖蛋白,。zui外層是α-和β-葡聚糖的混合物，第2層是糖蛋白的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),，葡聚糖與糖蛋白結(jié)合起來,，第3層主要是蛋白質(zhì)，zui內(nèi)層主要是幾丁質(zhì),，幾丁質(zhì)的微纖維嵌入蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中,。與酵母和細(xì)菌的細(xì)胞壁一樣，真菌細(xì)胞壁的強(qiáng)度和聚合物的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有關(guān),，不僅如此,，它還含有幾丁質(zhì)或纖維素的纖維狀結(jié)構(gòu)，所以強(qiáng)度有所提高,。
植物細(xì)胞
對于已生長結(jié)束的植物細(xì)胞壁可分為初生壁和次生壁兩部分,。 初生壁是細(xì)胞生長期形成的。 次生壁是細(xì)胞停止生長后,，在初生壁內(nèi)部形成的結(jié)構(gòu),。 較流行的初生細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)是由Lampert等人提出的“經(jīng)緯”模型，依據(jù)這一模型,，纖維素的微纖絲以平行于細(xì)胞壁平面的方向一層一層敷著在上面,，同一層次上的微纖絲平行排列，而不同層次上則排列方向不同,，互成一定角度,，形成獨(dú)立的網(wǎng)路，構(gòu)成了細(xì)胞壁的“經(jīng)”,，模型中的“緯”是結(jié)構(gòu)蛋白（富含羥脯氨酸的蛋白）,，它由細(xì)胞質(zhì)分泌，垂直于細(xì)胞壁平面排列,，并由異二酪氨酸交聯(lián)成結(jié)構(gòu)蛋白網(wǎng),，徑向的微纖絲網(wǎng)和緯向的結(jié)構(gòu)蛋白網(wǎng)之間又相互交聯(lián)，構(gòu)成更復(fù)雜的網(wǎng)路系統(tǒng),。半纖維素和果膠等膠體則填充在網(wǎng)路之中,，從而使整個(gè)細(xì)胞壁既具有剛性又具有彈性。在次生壁中,，纖維素和半纖維素含量比初生壁增加很多,，纖維素的微纖絲排列得更緊密和有規(guī)則。因此次生壁的形成提高了細(xì)胞壁的堅(jiān)硬性,，使植物細(xì)胞具有很高的機(jī)械強(qiáng)度,。
? 細(xì)胞破碎技術(shù)
破碎方法可規(guī)納為機(jī)械法和非機(jī)械法兩大類。
機(jī)械法
•高壓勻漿破碎法
高壓勻漿器是常用的設(shè)備,，它由可產(chǎn)生高壓的正向排代泵和排出閥組成,，排出閥具有狹窄的小孔，其大小可以調(diào)節(jié),。細(xì)胞漿液通過止逆閥進(jìn)入泵體內(nèi),，在高壓下迫使其在排出閥的小孔中高速沖出，并射向撞擊環(huán)上,，由于突然減壓和高速沖擊,，使細(xì)胞受到高的液相剪切力而破碎。在操作方式上,，可以采用單次通過勻漿器或多次循環(huán)通過等方式,，也可連續(xù)操作。為了控制溫度的升高,，可在進(jìn)口處用干冰調(diào)節(jié)溫度,，使出口溫度調(diào)節(jié)在20℃左右,。在工業(yè)規(guī)模的細(xì)胞破碎中，對于酵母等難破碎的及濃度高或處于生長靜止期的細(xì)胞,。
•振蕩珠擊破碎法
將等體積的小量組織樣品與高密度的ZircoBeads放入可密封的2ml螺旋蓋微量管中,，再加入緩沖液與穩(wěn)定成份到1.5ml的體積，用6500RPM振湯機(jī)高速上下振動8秒,，休息8秒,，再振動8秒即可。 一臺機(jī)器可以在一天處理2000支樣品,。對小量且多樣的人很方便,。
•高速攪拌珠研磨破碎法
研磨是常用的一種方法，它將細(xì)胞懸浮液與玻璃小珠,、石英砂或氧化鋁等研磨劑一起快速攪拌,，使細(xì)胞獲得破碎。在工業(yè)規(guī)模的破碎中,，常采用高速珠磨機(jī) ,。
•超聲波破碎法
超聲波破碎法利用超聲波振蕩器發(fā)射的15-25kHz的超聲波探頭處理細(xì)胞懸浮液。 超聲波振蕩器有不同的類型,，常用的為電聲型,，它是由發(fā)生器和換能器組成，發(fā)生器能產(chǎn)生高頻電流,，換能器的作用是把電磁振蕩轉(zhuǎn)換成機(jī)械振動,。超聲波振蕩器以可分為槽式和探頭直接插入介質(zhì)兩種型式。
非機(jī)械法
•滲透壓沖擊破碎法
滲透壓沖擊是較溫和的一種破碎方法,，將細(xì)胞放在高滲透壓的溶液中（如一定濃度的甘油或蔗糖溶液）,，由于滲透壓的作用，細(xì)胞內(nèi)水分便向外滲出,，細(xì)胞發(fā)生收縮,，當(dāng)達(dá)到平衡后，將介質(zhì)快速稀釋,，或?qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)入水或緩沖液中,，由于滲透壓的突然變化，胞外的水迅速滲入胞內(nèi),，引起細(xì)胞快速膨脹而破裂,。
•凍融破碎法
將細(xì)胞放在低溫下冷凍（約-15℃），然后在室溫中融化,，反覆多次而達(dá)到破壁作用,。由于冷凍，一方面能使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂,，從而增加細(xì)胞的親水性能,，另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶,，形成冰晶粒，引起細(xì)胞膨脹而破裂,。對于細(xì)胞壁較脆弱的菌體,，可采用此法。
•酶溶破碎法
酶解是利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞,，使細(xì)胞壁受到部分或*破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞細(xì)胞膜,，進(jìn)一步增大胞內(nèi)產(chǎn)物的通透性,。溶菌酶適用于革蘭氏陽性菌細(xì)胞的分解，應(yīng)用于革蘭氏陰性菌時(shí),，需輔以EDTA使之更有效地作用于細(xì)胞壁,。 真核細(xì)胞的細(xì)胞壁不同于原核細(xì)胞，需采用不同的酶,。
•化學(xué)破碎法
采用化學(xué)法處理可以溶解細(xì)胞或抽提胞內(nèi)組分,。常用酸、堿,、表面活性劑和有機(jī)溶劑等化學(xué)試劑,。