比色法蛋白質(zhì)定量

       蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的化合物，比色法測定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分:氨基酸(如酪氨酸,，絲氨酸)與外加的顯色基團(tuán)或者染料反應(yīng),，產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氨基酸數(shù)目直接相關(guān),，從而反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度,。

比色方法一般有BCA，Bradford,，Lowry 等幾種方法,。

        Lowry 法:以早期的Biuret 反應(yīng)為基礎(chǔ)，并有所改進(jìn),。蛋白質(zhì)與Cu2 反應(yīng),，產(chǎn)生藍(lán)色的反應(yīng)物。但是與Biuret 相比,，Lowry 法敏感性更高,。缺點(diǎn)是需要順序加入幾種不同的反應(yīng)試劑;反應(yīng)需要的時(shí)間較長;容易受到非蛋白物質(zhì)的影響;含EDTA，Triton x-100,，ammonia sulfate 等物質(zhì)的蛋白不適合此種方法,。

       BCA(Bicinchoninine acid assay)法:這是一種較新的,、更敏感的蛋白測試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2 反應(yīng)產(chǎn)生Cu ,，后者與BCA形成螯合物,，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波長,。此化合物與蛋白濃度的線性關(guān)系*,，反應(yīng)后形成的化合物非常穩(wěn)定。相對于Lowry法,，操作簡單,，敏感度高。但是與Lowry法相似的是容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾,。

       Bradford 法:這種方法的原理是蛋白質(zhì)與考馬斯亮蘭結(jié)合反應(yīng),，產(chǎn)生的有色化合物吸收峰595nm。其zui大的特點(diǎn)是,，敏感度好,，是Lowry 和BCA 兩種測試方法的2 倍;操作更簡單，速度更快;只需要一種反應(yīng)試劑;化合物可以穩(wěn)定1小時(shí),，方便結(jié)果;而且與一系列干擾Lowry,，BCA 反應(yīng)的還原劑(如DTT，巰基乙醇)相容,。但是對于去污劑依然是敏感的,。主要的缺點(diǎn)是不同的標(biāo)準(zhǔn)品會(huì)導(dǎo)致同一樣品的結(jié)果差異較大，無可比性,。

       某些初次接觸比色法測定的研究者可能為各種比色法測出的結(jié)果并不一致,，感到迷惑，究竟該相信哪種方法?由于各種方法反應(yīng)的基團(tuán)以及顯色基團(tuán)不一,，所以同時(shí)使用幾種方法對同一樣品得出的樣品濃度無可比性,。例如:Keller等測試人奶中的蛋白，結(jié)果Lowry,，BCA 測出的濃度明顯高于Bradford,，差異顯著。即使是測定同一樣品,，同一種比色法選擇的標(biāo)準(zhǔn)樣品不一致,，測試后的濃度也不一致。如用Lowry測試細(xì)胞勻漿中的蛋白質(zhì),，以BSA作標(biāo)準(zhǔn)品,，濃度1.34mg/ml，以a球蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品,，濃度2.64mg/ml,。因此,，在選擇比色法之前，是參照要測試的樣本的化學(xué)構(gòu)成,，尋找化學(xué)構(gòu)成類似的標(biāo)準(zhǔn)蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品,。另外，比色法定量蛋白質(zhì),，經(jīng)常出現(xiàn)的問題是樣品的吸光值太低,，導(dǎo)致測出的樣品濃度與實(shí)際的濃度差距較大。關(guān)鍵問題是,，反應(yīng)后1011分光光度計(jì)的重要配件-- 比色杯的顏色是有一定的半衰期,，所以每種比色法都列出了反應(yīng)測試時(shí)間，所有的樣品(包括標(biāo)準(zhǔn)樣品),，都必須在此時(shí)間內(nèi)測試,。時(shí)間過長，得到的吸光值變小,，換算的濃度值降低,。除此，反應(yīng)溫度,、溶液PH值等都是影響實(shí)驗(yàn)的重要原因,。此外，非常重要的是,，是用塑料的比色法,。避免使用石英或者玻璃材質(zhì)的比色杯，因?yàn)榉磻?yīng)后的顏色會(huì)讓石英或者玻璃著色,，導(dǎo)致樣品吸光值不準(zhǔn)確,。

        這種方法是在280nm波長，直接測試蛋白,。選擇Warburg 公式，光度計(jì)可以直接顯示出樣品的濃度,，或者是選擇相應(yīng)的換算方法,，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。蛋白質(zhì)測定過程非常簡單,，先測試空白液,，然后直接測試蛋白質(zhì)。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì),，一般要消除320nm 的"背景"信息,，設(shè)定此功能"開"。與測試核酸類似,，要求A280的吸光值至少大于0.1A,，*的線性范圍在1.0-1.5 之間,。實(shí)驗(yàn)中選擇Warburg 公式顯示樣品濃度時(shí)，發(fā)現(xiàn)讀數(shù)"漂移",。這是一個(gè)正常的現(xiàn)象,。事實(shí)上，只要觀察A280的吸光值的變化范圍不超過1%,，表明結(jié)果非常穩(wěn)定,。漂移的原因是因?yàn)閃arburg 公式吸光值換算成濃度，乘以一定的系數(shù),，只要吸光值有少許改變,，濃度就會(huì)被放大，從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定,。蛋白質(zhì)直接定量方法,，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質(zhì),。紫外直接定量法相對于比色法來說,，速度快，操作簡單;但是容易受到平行物質(zhì)的干擾,，如DNA的干擾;另外敏感度低,，要求蛋白的濃度較高。