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濾紙酶測試盒

微量法100T/48S

測定意義

纖維素酶是由微生物產(chǎn)生的多組分的酶系，能水解纖維素β-1,4葡萄糖苷鍵生成葡萄糖,，研究濾紙酶活力對纖維素酶的研究具有非常重要的意義,。

測定原理

濾紙酶水解濾紙產(chǎn)生的還原糖能與3,5-二硝基水楊酸生成紅棕色氨基化合物，在540nm處有最大光吸收,，在一定范圍內(nèi)反應液顏色深淺與還原糖的量成正比,，可測定計算得濾紙酶的活力。

自備實驗用品及儀器

天平,、研缽,、低溫離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板,、恒溫水浴鍋,。

試劑組成和配制

試劑一：液體25mL×1瓶，4℃保存,。

試劑二：液體40mL×1瓶,，4℃保存。

濾紙條：50mg×50條,。

酶液提取

1. 組織：按照質量（g）：蒸餾水體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g,，加入1mL蒸餾水）加入蒸餾水，冰浴勻漿后于4℃,，12000rpm離心10min,，取上清置于冰上待測。

2. 細胞：按照細胞數(shù)量（104個）：蒸餾水體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液）,，冰浴超聲波破碎細胞（功率300w,，超聲3秒，間隔7秒,，總時間3min）,；然后4℃，12000rpm離心10min,，取上清置于冰上待測,。

3. 培養(yǎng)液或其它液體：直接檢測。

測定操作

1. 根據(jù)樣本數(shù)量取兩倍數(shù)量的濾紙條和Ep管,，每支Ep管中放入一個卷狀濾紙條（注意要放入底部）,，作為底物。

2. 對照管：取200μL滅活的酶液,，加入500μL試劑一,，充分混勻，再加入放有濾紙條的Ep管中,，標注為對照管,。

3. 測定管：取200μL酶液,，加入500μL試劑一,，充分混勻，再加入放有濾紙條的Ep管中,，標注為測定管,。

4. 對照管和測定管同時置于50℃水浴鍋中反應30min。

5. 加入800μL試劑二,，沸水浴5min,，自來水冷卻后取200μL于微量石英比色皿/96孔板中測定540nm處吸光值，分別記為A對照管和A測定管，△A= A測定管- A對照管,。

酶活性計算公式

1. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標準曲線：y = 0.2805x - 0.0255,，R2 = 0.9991

（1）按照蛋白濃度計算

酶活性定義：在50℃，pH4.6條件下,，每毫克蛋白每分鐘分解濾紙產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位,。

FPA（U/mg prot）=（△A+0.0255）÷ 0.2805×V反總÷（V樣×Cpr）÷T

= 0.891×（△A+0.0255）÷ Cpr

（2）按照樣本質量計算

酶活性定義：在50℃，pH4.6條件下,，每克組織每分鐘分解濾紙產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位,。

FPA（U/g）=（△A+0.0255）÷ 0.2805×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷T

= 0.891×（△A+0.0255）÷ W

（3）按液體體積計算

酶活性定義：在50℃，pH4.6條件下,，每毫升培養(yǎng)液每分鐘分解濾紙產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位,。

FPA（U/mL）=（△A+0.0255）÷ 0.2805×V反總÷V樣÷T

= 0.891×（△A+0.0255）

（4）按細胞數(shù)量計算

酶活性定義：在50℃，pH4.6條件下,，每104個細胞每分鐘分解濾紙產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位,。

FPA（U/104cell）=（△A+0.0255）÷ 0.2805×V反總÷（V樣×細胞數(shù)量（萬個）÷V樣總）÷T

= 0.891×（△A+0.0255）÷ 細胞數(shù)量（萬個）

V反總：反應總體積，1.5mL,，V樣：反應體系中加入樣本體積,，0.2mL；V樣總：加入提取液體積,，1mL,；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL,；W：樣本質量,，g；T：反應時間,，30min

2. 用96孔板測定的計算公式如下

標準曲線：y = 0.1403x - 0.0255,，R2 = 0.9991

（1）按照蛋白濃度計算

酶活性定義：在50℃，pH4.6條件下,，每毫克蛋白每分鐘分解濾紙產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位,。

FPA（U/mg prot）=（△A+0.0255）÷ 0.1403×V反總÷（V樣×Cpr）÷T

=1.782×（△A+0.0255）÷ Cpr

（2）按照樣本質量計算

酶活性定義：在50℃，pH4.6條件下,，每克組織每分鐘分解濾紙產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位,。

FPA（U/g）=（△A+0.0255）÷ 0.1403×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷T

= 1.782×（△A+0.0255）÷ W

（3）按液體體積計算

酶活性定義：在50℃，pH4.6條件下,，每毫升培養(yǎng)液每分鐘分解濾紙產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位,。

FPA（U/mL）=（△A+0.0255）÷ 0.1403×V反總÷V樣÷T

= 1.782×（△A+0.0255）

（4）按細胞數(shù)量計算

酶活性定義：在50℃，pH4.6條件下,，每104個細胞每分鐘分解濾紙產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位,。

FPA（U/104cell）=（△A+0.0255）÷ 0.1403×V反總÷（V樣×細胞數(shù)量（萬個）÷V樣總）÷T

= 1.782×（△A+0.0255）÷ 細胞數(shù)量（萬個）

V反總：反應總體積,，1.5mL，V樣：反應體系中加入樣本體積,，0.2mL,；V樣總：加入提取液體積，1mL,；Cpr：樣本蛋白濃度,，mg/mL；W：樣本質量,，g,；T：反應時間，30min

注意事項

1. 用干凈的鑷子取出濾紙條,，帶手套卷成卷放入Ep管底部,。

2. 樣本滅活時保證同一批樣本處理時間一致，建議沸水浴十分鐘,。

3. 批量樣本測定之前先做1-2個樣本的預實驗,，若吸光值超過1.2，建議將樣本用蒸餾水稀釋后再進行測定,，計算公式中乘以稀釋倍數(shù),。

4. 顯色后取檢測液時注意槍頭不要碰到濾紙條，以免帶入毛狀物,，影響測定結果,。

上海牧榮生物科技有限公司

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