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甲醛脫氫酶（FDH）測試盒

微量法100T/96S

注意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義

甲醛是一種能與蛋白質(zhì),、核酸和脂類產(chǎn)生非特異性反應(yīng)的活潑化合物,，對所有生物都具有很高毒性。甲醛脫氫酶作為含鋅中等鏈醇脫氫酶（ADH）的家庭成員之一,，廣泛存在于原核和真核生物中,，該酶能利用NAD+作為輔酶，將有毒的甲醛氧化,，是甲醛氧化途徑中的關(guān)鍵酶,。

測定原理

甲醛脫氫酶催化甲醛和NAD+產(chǎn)生NADH，在340nm處的吸光值會增加,，測定340nm處的吸光值變化,，可計算得到甲醛脫氫酶的活性。

自備實驗用品及儀器

天平,、離心機,、酶標儀、96孔板,、蒸餾水,。

試劑組成和配制

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存,。

試劑一：液體15mL×1瓶,，4℃保存。

試劑二：粉劑×1瓶,，-20℃保存,；臨用前加入6mL水溶解待用,，用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融,。

試劑三：粉劑×1支,，4℃保存；臨用前加入1.5mL水溶解待用,。

試劑四：液體1.5mL×1支，4℃避光保存,。

FDH提取

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL提取液）進行冰浴勻漿，然后10000g,，4℃,，離心20min。

2. 細胞：按照細胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液）,，冰浴超聲波破碎細胞（功率300w,，超聲3秒，間隔7秒,，總時間3min）,；然后10000g，4℃,，離心10min,，取上清置于冰上待測。

3. 液體：直接檢測,。

測定操作表

1. 酶標儀預熱30min,，調(diào)節(jié)波長至340nm。

2. 操作表

在96孔板中加入如下試劑

混勻,，于340nm下測定初始吸光值A(chǔ)1與5min后的吸光值A(chǔ)2,，△A=A2-A1。

若樣本數(shù)量較多,，可將試劑按比例配成工作液使用,。

FDH酶活計算

（1）按蛋白濃度計算

酶活定義：每毫克蛋白每分鐘催化還原1nmol NAD+的酶量為1個酶活單位。

FDH酶活（nmol/min/mg prot）= ×V反總÷（V樣×Cpr）÷T = 643×△A÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計算

酶活定義：每克樣品每分鐘催化還原1nmol NAD+的酶量為1個酶活單位,。

FDH酶活（nmol/min/g 鮮重）= ×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T =643×△A÷W

（3）按照細胞數(shù)量計算

酶活定義：每104個細胞每分鐘催化還原1nmol NAD+的酶量為1個酶活單位,。

FDH酶活（nmol/min/104cell）= ×V反總÷（V樣÷V樣總×細胞數(shù)量（萬個））÷T= 643×△A÷細胞數(shù)量

（4）按液體體積計算

酶活定義：每mL樣本每分鐘催化還原1nmol NAD+的酶量為1個酶活單位。

FDH酶活（nmol/min/mL）= ×V反總÷V樣÷T=643×△A

：NADH微摩爾消光系數(shù),，6.22×10-3 L/µmol/cm,；d：96孔板光徑，0.5cm,；V反總：反應(yīng)體系總體積,，0.2mL,；V樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.02mL,；V樣總：加入提取液體積,，1mL；T,，反應(yīng)時間,，5min；Cpr：樣本蛋白濃度,，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量，g

上海牧榮生物科技有限公司

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