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堿性磷酸酶（AKP/ALP）測試盒

微量法 100T/48S

注意：正式測定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義：

AKP/ALP是一種含鋅的糖蛋白酶,，在堿性環(huán)境中可水解各種天然及人工合成的磷脂單酯化合物。AKP/ALP廣泛分布于人體各臟器中,，以肝臟為主。

測定原理：

在堿性環(huán)境中,，AKP/ALP催化磷酸苯二鈉生成游離酚,；酚與4-氨基安替比林和鐵氰*鉀反應(yīng)紅色亞醌衍生物，在510nm有特征光吸收,；通過測定510 nm吸光度增加速率,，來計(jì)算AKP活性。

自備儀器和用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀,、微量石英比色皿/96孔板,、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋,、可調(diào)式移液器和蒸餾水,。

試劑組成和配制：

試劑一：液體×1瓶，4℃保存,。

試劑二：液體×1瓶,，4℃避光保存。

試劑三：液體×1瓶,，4℃避光保存,。

試劑四：液體×1瓶，4℃避光保存,，未變成藍(lán)綠色之前均可使用,。

標(biāo)準(zhǔn)品：液體×1支（EP管中），2 μmol/mL酚標(biāo)準(zhǔn)液,，4℃保存,。

粗酶液提取：

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿,，4℃、8000g離心10min,，取上清液待測,。

2. 細(xì)菌或細(xì)胞：按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w,，超聲3秒,，間隔7秒，總時(shí)間3min）,；然后8000g,，4℃，離心10min,，取上清置于冰上待測,。

3. 血液可直接測定,，或者適當(dāng)稀釋后測定。

測定步驟：

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min,，調(diào)節(jié)波長到510 nm,，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑三置于37℃水浴中預(yù)熱30 min,。

3. 空白管：取EP管,，加入4μL蒸餾水，40μL試劑二,，40μL試劑三,，混勻后置于37℃水浴中保溫15min；加入試劑四120μL,，混勻后于510nm測定吸光度,，記為A空白管。

4. 標(biāo)準(zhǔn)管：取EP管,，加入4μL標(biāo)準(zhǔn)品,，40μL試劑二，40μL試劑三,，混勻后置于37℃水浴中保溫15min,；加入試劑四120μL，混勻后于510nm測定吸光度,，記為A標(biāo)準(zhǔn)管,。

5. 對照管：取EP管，加入4μL上清液,，40μL蒸餾水,，40μL試劑三，混勻后置于37℃水浴中保溫15min,；加入試劑四120μL,，混勻后于510nm測定吸光度，記為A測定管,。

6. 測定管：取EP管,，加入4μL上清液，40μL試劑二,，40μL試劑三,，混勻后置于37℃水浴中保溫15min；加入試劑四120μL,，混勻后于510nm測定吸光度,，記為A測定管。

其中標(biāo)準(zhǔn)管和空白管只需做一管，測定管和對照管每個(gè)樣均需做,。

注意：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需測定一次,。

AKP/ALP活性計(jì)算：

1. 血液中AKP/ALP活力計(jì)算

活性單位定義：37℃中每毫升血液每分鐘催化產(chǎn)生1μmol酚定義為1個(gè)酶活單位。

AKP/ALP活力(μmol/min /mL)= [C標(biāo)準(zhǔn)品×(A測定管-A對照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×V反總] ÷V樣÷T=6.8×(A測定管-A對照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)

2. 組織,、細(xì)菌或細(xì)胞中AKP/ALP活性計(jì)算

（1）按照蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 μ mol酚定義為1個(gè)酶活單位,。

AKP/ALP(μmol/min/mg prot)=[C標(biāo)準(zhǔn)品×(A測定管-A對照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×V反總]÷(Cpr×V樣)÷T=6.8×(A測定管-A對照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管) ÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：37℃中每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1 μ mol酚定義為1個(gè)酶活單位,。

AKP/ALP(μmol/min/g 鮮重)=[C標(biāo)準(zhǔn)品×(A測定管-A對照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=6.8×(A測定管-A對照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管) ÷W

（3）按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：37℃中每104個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1 μ mol酚定義為1個(gè)酶活單位,。AKP/ALP (μmol/min/104 cell)= [C標(biāo)準(zhǔn)品×(A測定管-A對照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×V反總]÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T= 6.8×(A測定管-A對照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管) ÷細(xì)胞數(shù)量

C標(biāo)準(zhǔn)品：2μmol/mL；V反總：反應(yīng)體系總體積（mL）,，205μL=0.205mL,； Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測定,，建議使用本公司生產(chǎn)的BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒,；W ：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積（mL）,，0.004mL,；V樣總：提取液體積，1 mL,；T：反應(yīng)時(shí)間（min）,，15 min。

注意事項(xiàng)：

1.試劑二,、試劑三和試劑四均需避光保存,。

2.試劑四變藍(lán)綠色后不能再使用。

3.加入試劑四后必須立即混勻,，否則顯色不全,。

上海牧榮生物科技有限公司

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