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磷酸果糖激酶（PFK）測試盒

微量法 100管/96樣

正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義

PFK（EC 2.7.1.11）廣泛存在于動物,、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,，負(fù)責(zé)將果糖-6-磷酸和ATP轉(zhuǎn)化為果糖-1,6二磷酸和ADP,，是糖酵解過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶之一。

測定原理

PFK催化果糖-6-磷酸和ATP生成果糖-1,6-二磷酸和ADP,，丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶進(jìn)一步依次催化NADH氧化生成NAD+,，在340nm下測定NADH下降速率，即可反映PFK活性,。

需自備的儀器和用品

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀,、水浴鍋,、臺式離心機(jī),、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板,、研缽,、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制

提取液：100mL×1瓶，4℃保存,；

試劑一：液體20mL×1瓶,，4℃保存；

試劑二：粉劑×1瓶,，-20℃保存；

試劑三：粉劑×1支,，4℃保存,；

試劑四：液體8μL×1支，4℃保存,；

樣本的前處理

1,、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清,；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為1000~5000：1的比例（建議2000萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液）,，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W,，超聲3s,，間隔10s，重復(fù)30次）,；8000g 4℃離心10min,，取上清，置冰上待測,。

2,、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL提取液）,，進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,，取上清，置冰上待測,。

3,、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟

1. 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長至340nm,，蒸餾水調(diào)零,。

2. 樣本測定

（1）在試劑二瓶中加入17mL試劑一和1.13mL蒸餾水充分溶解，置于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴5min,；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融；

（2）在試劑三中加入1mL蒸餾水充分混勻,，冰上放置備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融,；

（3）在試劑四中加入1mL蒸餾水充分混勻，冰上放置待用,；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融；

（4）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本,、10μL試劑三,、10μL試劑四和170μL試劑二，混勻,，立即記錄340nm處20s時的吸光值A(chǔ)1和 10min20s后的吸光值A(chǔ)2,，計(jì)算ΔA=A1-A2。

注意：不同勻漿組織中PFK活力不一樣,，做正式試驗(yàn)之前請做1-2只預(yù)試,，若ΔA>0.5，則說明活力太高,，必須用提取液稀釋成適當(dāng)濃度勻漿上清液（計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)）,，或縮短反應(yīng)時間至2min或5min,使ΔA<0.5，以提高檢測靈敏度,。

PFK活力單位的計(jì)算

a.用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下

1,、血清（漿）PFK活力的計(jì)算:

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP轉(zhuǎn)化為1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定義為一個酶活力單位。

PFK（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T=321×ΔA

2,、組織,、細(xì)菌或細(xì)胞中PFK活力計(jì)算：

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP轉(zhuǎn)化為1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定義為一個酶活力單位。

PFK（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=321×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g組織每分鐘催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP轉(zhuǎn)化為1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定義為一個酶活力單位,。

PFK（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=321×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP轉(zhuǎn)化為1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定義為一個酶活力單位,。

PFK（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(2000×V樣÷V樣總)÷T=0.1605×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L,；ε：NADH摩爾消光系數(shù),，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑,，1cm,；V樣：加入樣本體積，0.01 mL,；V樣總：加入提取液體積,，1 mL；T：反應(yīng)時間,，10 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量,，g；2000：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),，2000萬,。

b.用96孔板測定的計(jì)算公式如下

1、血清（漿）PFK活力的計(jì)算:

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP轉(zhuǎn)化為1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定義為一個酶活力單位,。

PFK（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T=642×ΔA

2,、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中PFK活力計(jì)算：

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP轉(zhuǎn)化為1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定義為一個酶活力單位,。

PFK（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=642×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g組織每分鐘催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP轉(zhuǎn)化為1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定義為一個酶活力單位,。

PFK（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=642×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP轉(zhuǎn)化為1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定義為一個酶活力單位。

PFK（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(2000×V樣÷V樣總)÷T=0.321×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積,，2×10-4 L,；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm,；d：96孔板光徑,，0.5cm；V樣：加入樣本體積,，0.01 mL,；V樣總：加入提取液體積，1 mL,；T：反應(yīng)時間,，10 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量，g,；2000：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),，2000萬。

上海牧榮生物科技有限公司

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