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糖原合成酶（GCS）測試盒

微量法 100管/96樣

正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

GCS（EC 2.4.1.11）催化UDPG和葡萄糖殘基生成糖原和UTP，以α-1，4-糖苷鍵相連延長糖鏈,，是肝和肌肉糖原合成酶的限速酶，是胰島素作用的主要靶酶,，對糖代謝的調(diào)節(jié)和血糖穩(wěn)態(tài)的維持具有重要作用,。

測定原理：

GCS催化UDPG和葡萄糖殘基生成糖原和UDP，丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶進(jìn)一步依次催化NADH氧化生成NAD+,，在340nm下測定NADH下降速率,，即可反映GCS活性。

需自備的儀器和用品：

分光光度計/酶標(biāo)儀,、臺式離心機(jī),、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板,、研缽,、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：100mL×1瓶,，4℃保存,；

試劑一：液體18 mL×1瓶， 4℃保存,；

試劑二：液體2.5mL×1瓶,，4℃保存；

試劑三：液體16.4uL×1支,，4℃保存,；

試劑四：粉劑×1支， -20℃保存,；

試劑五：粉劑×1支,， -20℃保存；

樣本的前處理：

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL提取液）,，進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,，取上清,，置冰上待測。

測定步驟：

1. 分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長至340nm,，蒸餾水調(diào)零。

2. 工作液的配制：臨用前將試劑三和試劑四轉(zhuǎn)移到試劑一中混合溶解待用,；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融。

3. 試劑五的配制：臨用前在試劑五中加入1mL試劑二充分溶解待用,；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融。

4. 將工作液和試劑五置于37℃預(yù)熱5分鐘,。

5. 在1mL微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本,、10μL試劑五和180μL工作液，立即混勻,，記錄340nm處初始吸光值A(chǔ)1和1min后的吸光值A(chǔ)2,，計算ΔA=A1-A2。

注意：在該試劑盒中,，若ΔA大于0.1,，需將樣本用提取液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后測定,，使ΔA小于0.1可提高檢測靈敏度。計算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù),。

GCS活性計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位,。

GCS（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=3215×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

GCS（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=3215×ΔA÷W

V反總：反應(yīng)體系總體積,，2×10-4 L,；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm,；d：比色皿光徑,，1cm；V樣：加入樣本體積,，0.01 mL,；V樣總：加入提取液體積，1 mL,；T：反應(yīng)時間,，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量，g,。

b.用96孔板測定的計算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位,。

GCS（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

GCS（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=6430×ΔA÷W

V反總：反應(yīng)體系總體積,，2×10-4 L,；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm,；d：96孔板光徑,，0.5cm；V樣：加入樣本體積,，0.01mL,；V樣總：加入提取液體積，1 mL,；T：反應(yīng)時間,，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量，g,。

上海牧榮生物科技有限公司

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