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更新時(shí)間:2024-05-08 17:31:02瀏覽次數(shù):566評(píng)價(jià)
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纖維素含量(CLL)測試盒
微量法 100管/96樣
正式測定前取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義:
纖維素是由葡萄糖組成的大分子多糖,,通常與半纖維素,、果膠和木質(zhì)素結(jié)合在一起,,是植物細(xì)胞壁的主要結(jié)構(gòu)成分,。纖維素是一種重要的膳食纖維,,是自然界中分布廣,、含量最多的一種多糖。
測定原理:
纖維素為β-葡萄糖殘基組成的多糖,,在酸性條件下加熱能分解成β-葡萄糖,。β-葡萄糖在強(qiáng)酸作用下,可脫水生成β-糠醛類化合物,。β-糠醛類化合物與蒽酮脫水縮合,,生成糠醛衍生物。顏色的深淺可間接定量測定纖維素含量,。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀,、水浴鍋、可調(diào)式移液器,、微量石英比色皿/96孔板,、80%乙醇、丙酮,、濃硫酸(不允許快遞),、研缽和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
試劑一:液體100mL× 1瓶,,4℃保存,。
試劑二:粉劑×1瓶,4℃避光保存,。
試劑三:液體10mL× 1支,,4℃保存,。
樣品的前處理:
細(xì)胞壁的提?。喝〖s0.3g樣本,加入1mL 80%乙醇,,室溫快速勻漿,,90℃水浴20min(加熱過程中EP管可能爆開,建議用膠帶封口或使用防爆EP管),,冷卻至室溫,,6000g 25℃離心10min,棄上清,。沉淀加入1.5mL80%乙醇和丙酮各洗一遍(渦旋振蕩2min左右,,6000g 25℃離心10min,棄上清即可),,沉淀即為粗細(xì)胞壁,,加入1mL試劑一(去除淀粉)浸泡15小時(shí),6000g 25℃離心10min,,棄上清,,將沉淀干燥,,稱重得細(xì)胞壁物質(zhì)(CWM)。
纖維素的提?。悍Q取烘干的CWM 約5mg,,加入0.5mL蒸餾水充分勻漿(若烘干物質(zhì)質(zhì)地堅(jiān)硬,可先研碎后再加入0.5mL蒸餾水勻漿,,或者用勻漿器勻漿),,勻漿液轉(zhuǎn)移至EP管中,用蒸餾水定容至0.5mL,,置于冰水浴中,,緩慢加入0.75mL濃硫酸,混勻,,冰水浴中靜置30min,。8000g 4℃離心10min,取上清液,,用蒸餾水稀釋20倍后待測,。
測定步驟:
1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,,調(diào)節(jié)波長至620nm,,蒸餾水調(diào)零。
2,、調(diào)節(jié)水浴鍋至95度,。
3、工作液的配制:在試劑二中加入4mL試劑三,,充分溶解,,如較難溶解,可加熱攪拌,;用不完的試劑4℃保存一周,;
4、加樣表(在EP管中反應(yīng)):
試劑(μL) | 空白管 | 測定管 |
樣本 | 150 | |
蒸餾水 | 150 | |
工作液 | 35 | 35 |
濃硫酸 | 315 | 315 |
混勻,,置95度水浴中10min(蓋緊,,以防止水分散失),冷卻至室溫后,,取200μL至微量石英比色皿或96孔板中,,于620nm處,分別讀取空白管和測定管吸光值,,ΔA=A測定管-A空白管,。
注意:
1、空白管只要做一管。
2,、由于濃硫酸具有強(qiáng)腐蝕性,,請謹(jǐn)慎操作。
纖維素含量計(jì)算:
a.用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下
1,、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為y = 7.875x - 0.0043,;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mg/mL),y為吸光值,。
2,、按樣本質(zhì)量計(jì)算:
纖維素(mg /g干重)= [(ΔA+0.0043) ÷7.875×V1]÷(W×V1÷V2)×20=3.17×(ΔA+0.0043) ÷W。
V1:加入樣本體積,,0.15mL,;V2:加入提取液體積,1.25mL,;W:樣本干重,,5×10-3g;20:樣本稀釋倍數(shù),。
b.用96孔板測定的計(jì)算公式如下
1,、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為y = 5.25x - 0.0043;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mg/mL),,y為吸光值,。
2、按樣本質(zhì)量計(jì)算:
纖維素(mg /g干重)= [(ΔA+0.0043) ÷5.25×V1]÷(W×V1÷V2)×20=4.76×(ΔA+0.0043)
÷W,。
V1:加入樣本體積,,0.15mL;V2:加入提取液體積,,1.25mL,;W:樣本干重,約5×10-3g,;20:樣本稀釋倍數(shù),。
注意:*低檢測限為1mg/g干重或10ng/ mg prot
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纖維素含量(CLL)測試盒
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