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紅霉素N脫甲基酶（ERND）測試盒

微量法 100T/48S

注意：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義：

細(xì)胞色素P450酶是一組主要存在于肝臟的酶系,，在外源物質(zhì)代謝中,，尤其是藥物和毒物的代謝,，具有重要作用。ERND在P450酶系中相當(dāng)于CYP2B亞型,，與藥物代謝的去甲基化密切相關(guān),。CYP2B具有催化底物形成非活性易于排泄的代謝產(chǎn)物而具有解毒作用，也可使某些藥物經(jīng)CYP2B代謝活化,。

測定原理：

ERND催化紅霉素釋放甲醛,，通過Nash比色測定甲醛含量，即可計(jì)算出ERND活性,。

自備儀器和用品：

普通離心機(jī),，超速離心機(jī)、可調(diào)式移液槍,、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀,、微量石英比色皿/96孔板、蒸餾水和冰,。

試劑組成和配置：

試劑一：粉劑×1瓶,，4℃保存。臨用前加100mL蒸餾水溶解,。

試劑二：液體×1瓶,，4℃保存。

試劑三：粉劑×1管,，4℃保存,。臨用前加1mL蒸餾水，充分溶解,。

試劑四：粉劑×1瓶,，4℃保存。臨用前加0.5mL蒸餾水,，充分溶解,。

試劑五：粉劑×1瓶，4℃保存,。臨用前,，加蒸餾水4.5mL充分溶解。

試劑六：液體×1瓶,，4℃保存,。

試劑七：液體×1瓶，4℃保存,。

標(biāo)準(zhǔn)液：液體×1瓶，-20℃保存,。臨用前取1.5mL EP 管,，加入10μl標(biāo)準(zhǔn)液,，加990μl蒸餾水，混勻即為0.05 mmol/L標(biāo)準(zhǔn)甲醛溶液,，4℃保存,。

粗酶液提取：

1,、除去細(xì)胞核,，線粒體等大分子物質(zhì)：稱約0.5g組織，加入1mL試劑一,，冰上充分研磨,，10 000g 4℃離心30min，取上清液,，轉(zhuǎn)入超速離心管中,。

2、粗制微粒體：100 000g,，4℃,，離心60min，棄上清液,。

3,、除血紅蛋白等雜質(zhì)：向步驟2的沉淀中加1mL試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解,，100 000g離心30min,，棄上清液。

4,、最終微粒體：向步驟3的沉淀中加試劑二0.5mL,，充分震蕩溶解，即粗酶液,，待測,。該待測液需當(dāng)天使用。

測定操作：

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min,，調(diào)節(jié)波長到412 nm,，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二置于37℃水浴中預(yù)熱30 min,。

3. 對照管：取0.5mL EP管,，加入10μL粗酶液，170μL試劑二,，10μL試劑三,，10μL蒸餾水，混勻后置于37℃水浴保溫30min,；立即加入35μL試劑五,，混勻后置于冰浴中5min,；取出后加入35μL試劑六，混勻后室溫靜置5min,；室溫8000rpm離心5min,；取新的EP管，加入100μL上清液,，100μL試劑七,，混勻后60℃水浴10min，然后取出,，用冷水冷卻5min,，于412nm測定光吸收，記為A對照管,。

4. 測定管：取0.5mL EP管,，加入10μL粗酶液，170μL試劑二,，10μL試劑三,，10μL試劑四，混勻后置于37℃水浴保溫30min,；立即加入35μL試劑五,，混勻后置于冰浴中5min；取出后加入35μL試劑六,，混勻后室溫靜置5min,；室溫8000rpm離心5min；取新EP管,，加入100μL上清液,，100μL試劑七，混勻后60℃水浴10min,，然后取出,，用冷水冷卻5min，于412nm測定光吸收,，記為A測定管,。

5. 標(biāo)準(zhǔn)管：取0.5mL EP管，加入100μL標(biāo)準(zhǔn)品,，100μL試劑七,，混勻后60℃水浴10min，然后取出,，用冷水冷卻5min,，于412nm測定光吸收，記為A標(biāo)準(zhǔn)管。

注意：每個樣品都需要做對照管,。

ERND活性計(jì)算公式：

a.使用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下

(1). 按照蛋白濃度計(jì)算:

活性單位定義：37℃下，每分鐘每毫克蛋白催化產(chǎn)生1nmol甲醛為1個酶活單位,。

ERND活性(nmol/min/mg prot) = C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×（A測定管－A對照管）÷A標(biāo)準(zhǔn)管×稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V樣）÷T

= 45×（A測定管－A對照管）÷A標(biāo)準(zhǔn)管÷Cpr。

(2). 按照樣本質(zhì)量計(jì)算:

活性單位定義：37℃下,，每分鐘每克樣品催化產(chǎn)生1nmol甲醛為1個酶活單位,。

ERND活性(nmol/min/g 鮮重) = C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×（A測定管－A對照管）÷A標(biāo)準(zhǔn)管×稀釋倍數(shù)÷（W×V樣）÷T

= 45×（A測定管－A對照管）÷A標(biāo)準(zhǔn)管÷W

C標(biāo)準(zhǔn)品：0.05 mmol/L=50μmol/L；V標(biāo)準(zhǔn)品：100μL=1×10-4 L,；稀釋倍數(shù)：V反總÷V上清液=（50+850 +50+50+175+175）÷500=2.7,；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測定,，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒,；W：樣品質(zhì)量，g,；V樣：加入粗酶液體積,，10μL=0.01mL；T：催化反應(yīng)時間（min）,，30min,。

b.使用96孔板測定的計(jì)算公式如下

(1). 按照蛋白濃度計(jì)算:

活性單位定義：37℃下，每分鐘每毫克蛋白催化產(chǎn)生1nmol甲醛為1個酶活單位,。

ERND活性(nmol/min/mg prot) = C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×（A測定管－A對照管）÷A標(biāo)準(zhǔn)管×稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V樣）÷T

= 45×（A測定管－A對照管）÷A標(biāo)準(zhǔn)管÷Cpr,。

(2). 按照樣本質(zhì)量計(jì)算:

活性單位定義：37℃下，每分鐘每克樣品催化產(chǎn)生1nmol甲醛為1個酶活單位,。

ERND活性(nmol/min/g 鮮重) = C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×（A測定管－A對照管）÷A標(biāo)準(zhǔn)管×稀釋倍數(shù)÷（W×V樣）÷T

= 45×（A測定管－A對照管）÷A標(biāo)準(zhǔn)管÷W

C標(biāo)準(zhǔn)品：0.05 mmol/L=50μmol/L,；V標(biāo)準(zhǔn)品：100μL=1×10-4 L；稀釋倍數(shù)：V反總÷V上清液=（50+850 +50+50+175+175）÷500=2.7,；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）,，需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒,；W：樣品質(zhì)量,，g；V樣：加入粗酶液體積,，10μL=0.01mL,； T：催化反應(yīng)時間（min），30min,。

上海牧榮生物科技有限公司

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