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鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨酶（OAT）測(cè)試盒

  微量法100T/96S

注意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義

脯氨酸是植物體內(nèi)適應(yīng)逆境脅迫的一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),。高等植物中脯氨酸代謝因其初始底物不同,，分為谷氨酸( Glu) 和鳥(niǎo)氨酸( Orn) 兩條合成途徑。鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨酶( δ-OAT) 是 是以鳥(niǎo)氨酸為前體合成脯氨酸途徑的關(guān)鍵酶,，對(duì)植物適應(yīng)逆境脅迫起關(guān)鍵作用,。

測(cè)定原理

鳥(niǎo)氨酸和α-酮戊二酸在鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨酶和NADH作用下發(fā)生氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)生成吡咯啉-5-羧酸（P5C），同時(shí)產(chǎn)生NAD,，通過(guò)檢測(cè)340nm處的吸光度的變化可反映出鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性的高低,。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器

天平、低溫離心機(jī),、研缽,、酶標(biāo)儀、96孔板,。

試劑組成和配制   

提取液：液體110mL×1瓶,，4℃保存。

試劑一：液體30 mL×1瓶,，4℃保存,。

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存,；臨用前加8mL試劑一充分溶解,；用不完的試劑4℃保存。

試劑三：粉劑×1瓶,，4℃保存,；臨用前加8mL試劑一充分溶解；用不完的試劑4℃保存,。

試劑四：粉劑×2瓶,，-20℃保存；臨用前每瓶加4mL試劑一充分溶解,；現(xiàn)配現(xiàn)用,。

酶液提取

1. 組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g，加入1mL提取液）加入提取液,，冰浴勻漿后于4℃,，10000g離心10min,，取上清置冰上待測(cè)。

2. 細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液）,，冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w,，超聲3秒，間隔7秒,，總時(shí)間3min）,；然后4℃，10000g離心10min,，取上清置冰上待測(cè),。

3. 液體：直接檢測(cè)。

測(cè)定操作

1. 酶標(biāo)儀預(yù)熱30min,，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm,。

2. 將配好的試劑二、三,、四37℃預(yù)熱5min,。（注意：粉劑試劑需要自行配制）

3. 取96孔板,，依次加入60μL試劑二,，60μL試劑三，60μL試劑四,，20μL粗酶液,，充分混勻，記錄340nm處初始吸光值和37℃反應(yīng)10min的吸光值A(chǔ)2,，△A=A1-A2,。

4. 計(jì)算公式

用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按照樣本蛋白濃度計(jì)算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

δ-OAT（nmol/min /mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T

=321.54×ΔA÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活單位定義：每克組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位,。

δ-OAT（nmol/min /g 鮮重）=ΔA÷（ε×d）×V反總÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T

=321.54×ΔA÷W

（3）按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活單位定義：每104個(gè)細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位,。

δ-OAT（nmol/min /104 cell）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總) ÷T

=321.54×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按照液體體積計(jì)算

酶活單位定義：每毫升液體每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

δ-OAT（nmol/min /mL）＝ΔA÷（ε×d）×V反總÷V樣÷T

=321.54×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積,，0.2mL,；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm,；d：96孔板光徑,，0.5cm；V樣：加入樣本體積,，0.02mL,；V樣總：加入提取液體積，1mL,；T：反應(yīng)時(shí)間,，10 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量,，g

上海牧榮生物科技有限公司

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7. 公司突出創(chuàng)新思維，提高工作效能，減低運(yùn)作成本,，為客戶(hù)提供優(yōu)惠的價(jià)格,。

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