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?；D(zhuǎn)移酶（AAT）測試盒

微量法 100管/96樣

注意：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義：

AAT是一個多功能蛋白大家族,，主要負(fù)責(zé)催化生物體內(nèi)各種?；腿ヵ；磻?yīng),，在基因表達(dá),、代謝和信號傳導(dǎo)中具有重要作用。

測定原理：

AAT催化乙酰CoA轉(zhuǎn)移乙?；蕉〈?，釋放的CoA還原DTNB生成TNB；TNB在412nm有吸收峰,，測定412 nm吸光度增加速率可計算AAT活性,。

自備儀器和用品：

研缽、冰,、臺式離心機(jī),、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板,、恒溫水浴鍋,、無水乙醇。

試劑組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶,，4℃保存,；

試劑一：液體20mL×1瓶，4℃保存,；

試劑二：粉劑×1瓶,，-20℃保存。

試劑三：粉劑×1支,，4℃避光保存,。

粗酶液提取：

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿,。8000g，4℃離心10min,，取上清置冰上待測,。

2. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液）,，冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w,，超聲3秒，間隔7秒,，總時間3min）,；然后8000g，4℃,，離心10min,，取上清置于冰上待測。

3. 液體：直接檢測,。

AAT測定操作：

1,、分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長到412 nm,，蒸餾水調(diào)零,。

2、工作液的配制：臨用前在試劑二瓶中加入18mL試劑一,，充分混勻待用,。用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融,。

3,、試劑三的配制：臨用前加無水乙醇1mL充分溶解待用，用不完的試劑4℃保存,。

4,、 空白管：在Ep管或96孔板中加入10μL提取液和180μL工作液，充分混勻,，35℃反應(yīng)15min,，加入10μL試劑三，充分混勻,，25℃靜置10min,，測定412nm處吸光值，記為A空白管,。

5,、 測定管：在Ep管或96孔板中加入10μL樣本和180μL工作液，充分混勻,，35℃反應(yīng)15min,，加入10μL試劑三,，充分混勻，25℃靜置10min,，測定412nm處吸光值,，記為A測定管?！鰽=A測定管- A空白管,，空白管只要做一管。

AAT活性計算：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按照蛋白濃度計算

活性單位定義：每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個酶活單位,。

AAT (nmol/min/mg prot) = △A ÷（×d）×V反總÷（V樣×Cpr）÷T = 98.04×△A÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個酶活單位,。

AAT (nmol/min /g 鮮重) = △A ÷（×d）×V反總÷(W×V樣÷V樣總) ÷T 

= 98.04×△A÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計算

活性單位定義：每104個細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個酶活單位。

AAT (nmol/min/104cell) = △A ÷（×d）×V反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總) ÷T

= 98.04×△A÷ 細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計算

活性單位定義：每毫升樣品每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個酶活單位,。

AAT (nmol/min/mL) = △A ÷（×d）×V反總÷V樣÷T

 = 98.04×△A

：TNB消光系數(shù),，13600L/mol/cm；d：比色皿光徑：1cm,；V反總：反應(yīng)總體積,，0.2mL；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積,，0.01mL,；V樣總：加入提取液體積，1mL,；Cpr：蛋白含量,，mg/mL；W：樣本質(zhì)量,，g,；T：反應(yīng)時間，15 min,。

b.使用96孔板測定的計算公式如下

（1）按照蛋白濃度計算

活性單位定義：每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個酶活單位,。

AAT (nmol/min/mg prot) = △A ÷（×d）×V反總÷（V樣×Cpr）÷T 

=196.08×△A÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個酶活單位。

AAT (nmol/min /g 鮮重) = △A ÷（×d）×V反總÷(W×V樣÷V樣總) ÷T 

= 196.08×△A÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計算

活性單位定義：每104個細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個酶活單位,。

AAT (nmol/min/104cell) = △A ÷（×d）×V反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總) ÷T

=196.08×△A÷ 細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計算

活性單位定義：每毫升樣品每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個酶活單位,。

AAT (nmol/min/mL) = △A ÷（×d）×V反總÷V樣÷T

 = 196.08×△A

：TNB消光系數(shù)，13600L/mol/cm,；d：96孔板光徑：0.5cm,；V反總：反應(yīng)總體積，0.2mL,；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積,，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，1mL,；Cpr：蛋白含量,，mg/mL；W：樣本質(zhì)量,，g,；T：反應(yīng)時間,，15min,。

上海牧榮生物科技有限公司

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