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轉(zhuǎn)氫酶1測試盒

微量法 100管/96樣

正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義

TH位于線粒體的內(nèi)膜上,，又稱為呼吸電子傳遞鏈復(fù)合體六,，催化NADH+NADP+和 NAD++NADPH相互轉(zhuǎn)化。催化正向反應(yīng)稱為TH-1,。線粒體NADH含量增加時會導(dǎo)致線粒體膜的H+電化學(xué)梯度升高,，因而促進(jìn)了電子傳遞鏈上ROS的產(chǎn)生。TH-1促進(jìn)NADH轉(zhuǎn)換為NADPH,，從而提高線粒體的抗氧化能力,。

測定原理

NADH和NADPH均在340nm有特征吸收，因此TH催化的轉(zhuǎn)氫反應(yīng)不能導(dǎo)致340nm吸光度發(fā)生變化,。用人工合成底物3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸磷酸（APADP+）替代NADP+,，TH-1催化 APADP+還原生成的APADPH在375nm有特征光吸收，因此通過測定375nm光吸收增加速率,，來計算TH-1活性,。

需自備的儀器和用品

可見分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機,、水浴鍋,、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板,、研缽,、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制

試劑一：液體100mL×1瓶,，-20℃保存,；

試劑二：液體50mL×1瓶，-20℃保存,；

試劑三：液體18mL×1瓶,，4℃保存；

試劑四：粉劑×1支,，-20℃保存,；

試劑五：粉劑×1支，-20℃保存,；

樣本的前處理：

組織,、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

• 準(zhǔn)確稱取0.1g組織或收集500萬細(xì)胞，加入1mL試劑一,，用冰浴勻漿器或研缽勻漿,。

• 將勻漿600g,，4℃離心5min。

• 棄沉淀,，將上清液移至另一離心管中,，11100g，4℃離心10min,。

• 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,，可用于測定從線粒體泄漏的TH-1（此步可選做）。

• 步驟④中的沉淀即為線粒體,，加入500uL試劑二,，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W,，超聲3s,，間隔10秒，重復(fù)30次）,，用于TH-1活性測定。

測定步驟：

1. 分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長至375nm,，蒸餾水調(diào)零。

2. 樣本測定

（1）工作液的配制：臨用前將試劑四,、五轉(zhuǎn)移到試劑三中混合溶解,，置于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴5min；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融,。

（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入20μL樣本和180μL工作液，混勻,，立即記錄375nm處初始吸光值A(chǔ)1和 10min后的吸光值A(chǔ)2,，計算ΔA=A2-A1。

TH-1活性計算

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1） 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1 nmol APADPH定義為一個酶活性單位,。

 TH-1活性（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr)÷T=149×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織每分鐘產(chǎn)生1 nmol APADPH定義為一個酶活性單位,。

TH-1活性（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=74.5×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算

單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1 nmol APADPH定義為一個酶活性單位。

TH-1活性（nmol/min /104 cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.149×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積,，2×10-4 L,；ε：APADPH摩爾消光系數(shù)，6.7×103 L / mol /cm,；d：比色皿光徑,，1cm；V樣：加入樣本體積,，0.02 mL,；V樣總：加入提取液體積,，0.5mL；T：反應(yīng)時間,，10 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量,，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),，500萬,。

b.用96孔板測定的計算公式如下

（1） 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1 nmol APADPH定義為一個酶活性單位。

 TH-1活性（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr)÷T=298×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織每分鐘產(chǎn)生1 nmol APADPH定義為一個酶活性單位,。

TH-1活性（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=149×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算

單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1 nmol APADPH定義為一個酶活性單位,。

TH-1活性（nmol/min /104 cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.298×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L,；ε：APADPH摩爾消光系數(shù),，6.7×103 L / mol /cm；d：96孔板光徑,，0.5cm,；V樣：加入樣本體積，0.02 mL,；V樣總：加入提取液體積,，0.5mL；T：反應(yīng)時間,，10 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量,，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),，500萬,。

上海牧榮生物科技有限公司

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