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葡萄糖6磷酸酶（G6P)測試盒

微量法 100管/96樣

正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

葡萄糖-6-磷酸酶（(glucose 6 phosphatase,，G6Pase，EC 3.1.3.9）廣泛存在于動物,、植物,、微生物和細胞中，是糖異生過程水解葡萄糖-6-磷酸生成葡萄糖的限制酶,，在保證血糖的動態(tài)平衡方面起著重要的作用,。

測定原理：

G6P催化葡萄糖-6-磷酸生成葡萄糖，變旋酶和葡萄糖脫氫酶進一步依次催化NAD+還原生成NADH,，在340nm下測定NADH生成速率,，即可反映G6P活性。

需自備的儀器和用品：

分光光度計/酶標儀,、臺式離心機,、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板,、研缽,、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：100mL×1瓶,，4℃保存,；

試劑一：液體19 mL×1瓶， 4℃保存,；

試劑二：粉劑×1支,，-20℃保存；

試劑三：粉劑×1支,，-20℃保存,；

試劑四：試劑×1支，-20℃保存,；

樣本的前處理： 

1,、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi),，離心后棄上清,；按照細菌或細胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液）,，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴,，功率20％或200W，超聲3s,，間隔10s,，重復30次）；8000g 4℃離心10min,，取上清，置冰上待測,。

2,、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿,。8000g 4℃離心10min,，取上清，置冰上待測,。

3,、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1. 分光光度計或酶標儀預熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長至340nm,，蒸餾水調(diào)零。

工作液的配制：臨用前將試劑二,、試劑三和試劑四轉(zhuǎn)移到試劑一中混合溶解待用,；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融,。

2. 將工作液置于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)預熱5分鐘,。

3. 在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本和190μL工作液，立即混勻,，記錄340nm處初始吸光值A1和 2min后的吸光值A2,，計算ΔA=A2-A1。

注意：在該試劑盒中,，若ΔA大于0.3,，需將樣本用提取液稀釋適當倍數(shù)后測定，使ΔA小于0.3可提高檢測靈敏度,。計算公式中乘以相應稀釋倍數(shù),。
 

G6P活性計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、血清（漿）G6P活力計算

單位定義：每毫升血清（漿）每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個酶活力單位,。

G6P（nmol/min/mL））＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T=1608×ΔA

2,、組織、細菌或細胞中G6P活力計算

（1）按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1nmol NADH定義為一個酶活力單位,。

G6P（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位定義：每g組織每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個酶活力單位,。

G6P（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=1608×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

G6P（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=3.215×ΔA

V反總：反應體系總體積,，1×10-3 L,；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm,；d：比色皿光徑,，1cm；V樣：加入樣本體積,，0.05 mL,；V樣總：加入提取液體積,，1 mL；T：反應時間,，2 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量,，g；500：細菌或細胞總數(shù),，500萬,。

b.用96孔板測定的計算公式如下

1、血清（漿）G6P活力計算

單位定義：每毫升血清（漿）每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個酶活力單位,。

G6P（nmol/min/mL））＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T=3216×ΔA

2,、組織、細菌或細胞中G6P活力計算

（1）按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1nmol NADH定義為一個酶活力單位,。

G6P（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位定義：每g組織每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個酶活力單位,。

G6P（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=3216×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位定義：每1萬個細胞或細胞每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

G6P（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=6.43×ΔA

V反總：反應體系總體積,，2×10-4 L,；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm,；d：96孔板光徑,，0.5cm；V樣：加入樣本體積,，0.01 mL,；V樣總：加入提取液體積，1 mL,；T：反應時間,，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量，g,；500：細菌或細胞總數(shù),，500萬。

上海牧榮生物科技有限公司

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