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胰蛋白酶測(cè)試盒

 微量法 100T/96S

注意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定,。

測(cè)定意義：                           

胰蛋白酶選擇性水解變性蛋白質(zhì)中由賴氨酸或精氨酸的羧基所構(gòu)成的肽鏈，是一種重要的消化酶。此外,，胰蛋白酶還廣泛應(yīng)用于膿胸、血胸,、外科炎癥,、潰瘍、創(chuàng)傷性損傷等所產(chǎn)生的局部水腫,、血腫及膿腫等的輔助治療,。

測(cè)定原理：

胰蛋白酶催化水解TAME的酯鍵，釋放出的游離羧基與反應(yīng)體系中的氫氧化鈉發(fā)生中和反應(yīng),，導(dǎo)致溶液的pH值降低,，以苯酚紅為指示劑，測(cè)定溶液在555nm處吸收值的變化,，可以快速測(cè)得胰蛋白酶活性數(shù)據(jù),。胰蛋白酶在一定范圍內(nèi)與555nm處吸收值的降低呈良好的線性關(guān)系。

自備儀器和用品：

酶標(biāo)儀,、96孔板,、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋,、可調(diào)式移液器,、研缽、冰和蒸餾水,。

試劑組成和配制：

提取液：液體120 mL×1瓶,，4℃保存。

試劑一：液體5 mL×1瓶,，4℃保存,。

試劑二：液體5 mL×1瓶，4℃避光保存,。

試劑三：液體2 mL×1瓶,，4℃保存。

粗酶液提取：

1. 組織樣品：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL提取液）冰浴勻漿,，10000g，4℃離心10min,，取上清,，即粗酶液。

測(cè)定步驟：

1. 酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min,，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到555 nm,。

2. 工作液的配制：臨用前根據(jù)用量按照試劑一（V）：試劑二（V）：蒸餾水（V）：試劑三（V）=1 mL：1 mL：5.4 mL：0.4 mL的比例充分混合。（注意：現(xiàn)用現(xiàn)配,，用多少配多少,，在空瓶中配制，試劑盒中帶有4個(gè)空瓶）

3. 吸取5μL樣本,，加入195 μL工作液,，混勻后立即測(cè)定，記錄555nm下1min時(shí)的吸光值A(chǔ)1和2min時(shí)的吸光值A(chǔ)2,。計(jì)算△A=A1-A2

注意：如果△A小于0.005，可將反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)到5min,。如果△A大于0.5,，體系迅速變色，可將樣本用提取液稀釋后測(cè)定（建議稀釋10倍）,，計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù),。

胰蛋白酶活性計(jì)算公式：

使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：室溫下每毫克蛋白質(zhì)每分鐘催化555nm處吸光值減少0.5為1個(gè)酶活單位。

胰蛋白酶（U/mg prot）= △A ×V反總 ÷（Cpr×V1）÷0.5÷T

=80×△A ÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：室溫每克組織每分鐘催化555nm處吸光值減少0.5為1個(gè)酶活單位,。

胰蛋白酶（U/g 鮮重）= △A×V反總÷（W×V1÷V2）÷0.5÷T=80×△A ÷W

Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）,，需要另外測(cè)定；W：組織質(zhì)量（g）,；V1：加入反應(yīng)體系中粗酶液體積（mL）,，5 μL=0.005 mL；V2：粗酶液總體積（mL）,，1 mL,；V反總：反應(yīng)總體積，0.2 mL,；T：反應(yīng)時(shí)間（min）,，1 min。

上海牧榮生物科技有限公司

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