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胞漿異檸檬酸脫氫酶（ICDHc）測試盒
微量法 100管/96樣
正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義：
ICDHc（EC 1.1.1.42）廣泛存在于動物、植物,、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,，催化異檸檬酸脫氫脫羧生成 α-酮戊二酸，同時還原NADP+生成NADPH,。ICDHc是細(xì)胞質(zhì)中除了磷酸戊糖途徑外又一種NADPH重要來源,，在逆境中該酶活性通常會發(fā)生顯著變化,。
測定原理：
利用ICDHc催化NADP+還原成NADPH反應(yīng)，在340 nm下測定NADPH濃度的增加,。
所需的儀器和用品:
紫外分光光度計/酶標(biāo)儀,、恒溫水浴鍋、臺式離心機(jī),、可調(diào)式移液器,、微量石英比色皿/96孔板、研缽,、冰和蒸餾水,。
試劑的組成和配制：
提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存,；
試劑一：液體19 mL×1瓶,，4℃保存；
試劑二：粉劑×1瓶,，4℃保存,；
試劑三：粉劑×1瓶，-20℃保存,；
樣本的前處理：
1,、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),，離心后棄上清,；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴,，功率20％或200W,，超聲3s，間隔10s,，重復(fù)30次）,；8000g 4℃離心10min，取上清,，置冰上待測。
組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL提取液）,，進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,，取上清,，置冰上待測。
2,、血清（漿）樣品：直接檢測,。
測定步驟：
分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零,。
將試劑二和試劑三轉(zhuǎn)移至試劑一中充分溶解,；在37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴10min以上；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融,。
3、 在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本和190μL試劑一,，混勻后立即記錄340nm處20s后吸光值A(chǔ)1和 2min20s后的吸光值A(chǔ)2,，計算ΔA=A2-A1。
注意事項(xiàng)：
若A2-A1大于0.5,，需將酶液用提取液稀釋,，使A2-A1小于0.5，可提高檢測靈敏度,。計算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù),。
若A2-A1小于0.005，可延長反應(yīng)時間到5min或10min,。
ICDHc活力單位的計算：
a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下
1,、血清（漿）ICDHc活力的計算:
單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位。
ICDHc（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T=1608×ΔA
2,、組織,、細(xì)菌或細(xì)胞中ICDHc活力的計算:
（1）按樣本蛋白濃度計算：
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位。
ICDHc（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr
（2）按樣本鮮重計算：
單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位,。
ICDHc（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=1608×ΔA÷W
（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：
單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位,。
ICDHc（nmol/min/104）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=3.216×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L,；ε：NADPH摩爾消光系數(shù),，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑,，1cm,；V樣：加入樣本體積，0.01 mL,；V樣總：加入提取液體積,，1 mL；T：反應(yīng)時間,，2 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量,，g,；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬,。
b.用96孔板測定的計算公式如下
1,、血清（漿）ICDHc活力的計算：
單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位,。
ICDHc（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T=3216×ΔA
2,、組織,、細(xì)菌或細(xì)胞中ICDHc活力的計算：
（1）按樣本蛋白濃度計算：
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位。
ICDHc（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr
（2）按樣本鮮重計算：
單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位,。
ICDHc（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=3216×ΔA÷W
（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：
單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位,。
ICDHc（nmol/min/104）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=6.432×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L,；ε：NADPH摩爾消光系數(shù),，6.22×103 L / mol /cm；d：96孔板光徑,，0.5cm,；V樣：加入樣本體積，0.01 mL,；V樣總：加入提取液體積,，1 mL；T：反應(yīng)時間,，2 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量,，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),，500萬,。
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