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羧酸酯酶（CarE）測試盒

 微量法 100T/96S

注意：正式測定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定,。

測定意義：

哺乳動(dòng)物CarE,，也稱脂族酯酶（aliesterase）,，廣泛分布于組織和器官，屬于絲氨酸水解酶家族,。CarE催化含酯鍵,、酰胺鍵和硫酯鍵的內(nèi)源性與外源性物質(zhì)水解，但不能催化水解乙酰膽堿及其類似物,。CarE參與脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝,，并且與多種藥物、環(huán)境毒物以及致癌物的解毒和代謝有關(guān),，有機(jī)磷農(nóng)藥可結(jié)合并且抑制CarE活性,。

測定原理：

CarE能催化乙酸-1-萘酯生成萘酯，固籃顯色,；在450 nm光吸收增加速率，計(jì)算CarE活性,。

自備儀器和用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀,、微量玻璃比色皿/96孔板、低溫離心機(jī),、水浴鍋,、可調(diào)式移液槍和蒸餾水。

試劑組成和配置：

試劑一：液體×1瓶,，4℃保存,。

試劑二：液體15mL×2瓶， 4℃保存,；

試劑三：粉劑×2支,， 4℃保存，臨用前取1支試劑三,，加0.6ml無水乙醇充分溶解,；

試劑四：粉劑×2支，-20℃保存,，臨用前取1支試劑四,，加少量試劑二溶解；

工作液配制：臨用前配制,，向1瓶試劑二中,，加入溶解后的試劑三和試劑四各1支，充分溶解,，過濾,，4℃避光保存，可用1周,。

粗酶液提?。?/p>

細(xì)菌,、細(xì)胞樣品制備

收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清,；按照每200萬細(xì)菌或細(xì)胞加入400μL試劑一,，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率20％，超聲3s,，間隔10s,，重復(fù)30次）；12000g 4℃離心30min,，取上清液待測,。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿,；12000g 4℃離心30min，取上清液待測,。

3,、液體：直接測定

測定操作：

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長到450 nm,，蒸餾水調(diào)零,。

2. 試劑二置于37℃水浴中預(yù)熱30 min。

3. 空白管：取微量玻璃比色皿/96孔板,，依次加入5μL蒸餾水和200μL試劑二,，迅速混勻，于450nm處測定3min內(nèi)吸光值變化,，第10s吸光值記為A1,，第190s吸光值記為A2?！鰽空白管=A2-A1

4. 測定管：取微量玻璃比色皿/96孔板,，依次加入5μL上清液和200μL試劑二，迅速混勻,，于450nm處測定3min內(nèi)吸光值變化,，第10s吸光值記為A3，第190s吸光值記為A4,?！鰽測定管=A4-A3

注意：空白管只需測定一次。

CarE活性計(jì)算公式：

1. 使用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下

1 組織中CarE活性

1. 按蛋白濃度計(jì)算

CarE活性單位定義：每mg組織蛋白在37℃反應(yīng)體系中每分鐘催化吸光值增加1定義為1個(gè)酶活單位,。

CarE酶活(U/mg prot)= (△A測定管-△A空白管) ×V反總÷(Cpr×V樣)÷T

= 13.67×(△A測定管-△A空白管)÷Cpr

2. 按樣本鮮重計(jì)算

CarE活性單位定義：每g組織在37℃反應(yīng)體系中每分鐘催化吸光值增加1定義為1個(gè)酶活單位,。

CarE酶活(U/g 鮮重)= (△A測定管-△A空白管) ×V反總×（V樣總÷V樣）÷W÷T

=13.67×(△A測定管-△A空白管)÷W

2 細(xì)菌或細(xì)胞中CarE活性

CarE活性單位定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在37℃反應(yīng)體系中每分鐘催化吸光值增加1定義為一個(gè)CarE活性單位。

CarE酶活(U/104 cell)= (△A測定管-△A空白管) ×V反總×（V樣總÷V樣）÷細(xì)胞密度（104 cell/mL）÷T=13.67×(△A測定管-△A空白管)÷細(xì)胞密度（104 cell/mL）

3. 液體中CarE活性

CarE活性單位定義：每毫升樣品在37℃反應(yīng)體系中每分鐘催化吸光值增加1定義為1個(gè)酶活單位,。

CarE酶活(U/mL )= (△A測定管-△A空白管) ×V反總÷V樣÷T

=13.67×(△A測定管-△A空白管)

V反總：反應(yīng)體系總體積,，205μL=2.05×10-4L,；V樣總：上清液總體積，1 mL,；V樣：加入上清液體積(mL),，0.005 mL；Cpr：蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；W：樣品質(zhì)量（g）；T：反應(yīng)時(shí)間（min）,，3min,。

2. 使用96孔板測定的計(jì)算公式如下

1 組織中CarE活性

3. 按蛋白濃度計(jì)算

CarE活性單位定義：每mg組織蛋白在37℃反應(yīng)體系中每分鐘催化吸光值增加1定義為1個(gè)酶活單位。

CarE酶活(U/mg prot)= (△A測定管-△A空白管) ×V反總÷(Cpr×V樣)÷T

= 13.67×(△A測定管-△A空白管)÷Cpr

4. 按樣本鮮重計(jì)算

CarE活性單位定義：每g組織在37℃反應(yīng)體系中每分鐘催化吸光值增加1定義為1個(gè)酶活單位,。

CarE酶活(U/g 鮮重)= (△A測定管-△A空白管) ×V反總×（V樣總÷V樣）÷W÷T

=13.67×(△A測定管-△A空白管)÷W

2 細(xì)菌或細(xì)胞中CarE活性

CarE活性單位定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在37℃反應(yīng)體系中每分鐘催化吸光值增加1定義為一個(gè)CarE活性單位,。

CarE酶活(U/104 cell)= (△A測定管-△A空白管) ×V反總×（V樣總÷V樣）÷細(xì)胞密度（104 cell/mL）÷T=13.67×(△A測定管-△A空白管)÷細(xì)胞密度（104 cell/mL）

3. 液體中CarE活性

CarE活性單位定義：每毫升樣品在37℃反應(yīng)體系中每分鐘催化吸光值增加1定義為1個(gè)酶活單位。

CarE酶活(U/mL )= (△A測定管-△A空白管) ×V反總÷V樣÷T

=13.67×(△A測定管-△A空白管)

V反總：反應(yīng)體系總體積,，205μL=2.05×10-4L,；V樣總：上清液總體積，1 mL,；V樣：加入上清液體積(mL)，0.005 mL,；Cpr：蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL；W：樣品質(zhì)量（g）,；T：反應(yīng)時(shí)間（min）,，3min。

上海牧榮生物科技有限公司

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