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羥脯氨酸（HYP）測試盒  

微量法100T/96S

注意：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定,。

測定意義：

HYP是機(jī)體膠原蛋白主要成分之一，膠原蛋白大多分布于皮膚,、腱、軟骨和血管等,，因此HYP含量是反映膠原組織代謝及纖維化程度的一項重要指標(biāo),。

測定原理：

樣品經(jīng)水解產(chǎn)生游離的HYP，進(jìn)一步被氯胺T氧化,，氧化產(chǎn)物與對二甲氨基苯甲醛反應(yīng),，產(chǎn)生紅色化合物，在560nm處有特征吸收峰,。通過測定樣品水解液560nm吸光值,，可計算HYP含量。

自備實驗用品及儀器：

天平,、烘箱,、玻璃管、離心機(jī),、水浴鍋,、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板,、無水乙醇,、異丙醇、6mol/L鹽酸和蒸餾水,。

試劑組成和配制：

組織提取液：6mol/L鹽酸,，自備。濃鹽酸：H2O（V/V）= 1:1,，室溫保存,。

細(xì)胞提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存,。

試劑一：液體6mL×1瓶,，4℃避光保存。

試劑二：液體6mL×1瓶,，4℃避光保存,。

羥脯氨酸提取：

1. 組織：稱取約0.2g樣品于玻璃管,，加入2mL的組織提取液,，置于110℃烘箱，水解6至12小時,，用提取液定容至2mL,，12000g，25℃,，離心20min,，取上清待測,。

2. 細(xì)胞：取約500萬個細(xì)胞，加入1mL的細(xì)胞提取液,，于高壓消毒器中15磅保持30min,，自然降壓后待測。

3. 血清游離羥脯氨酸提?。喝?.1mL血清,，加入0.5mL無水乙醇使蛋白質(zhì)沉淀，8000g4℃離心5min,。將上清倒入另一個EP管,，氮吹或沸水浴將乙醇揮發(fā)干。冷卻后再加入0.2mL50%異丙醇,，充分溶解混勻待測,。

測定操作表：

1. 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長至560nm,，蒸餾水調(diào)零,。

2. 操作表

羥脯氨酸含量計算公式：

1. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=64.875x+ 0.0251，R2=0.9991

（1）按樣品重量計算

組織羥脯氨酸含量（mg/g 鮮重）=（ΔA-0.0251）÷64.875×V反總÷(V樣÷V樣總×W)

                        = 0.154×（ΔA-0.0251）÷W

（2）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算

細(xì)胞羥脯氨酸含量（mg/104 cell）=（ΔA-0.0251）÷64.875×V反總÷V樣×V樣總÷細(xì)胞數(shù)量（萬個）= 0.077×（ΔA-0.0251）÷ 細(xì)胞數(shù)量（萬個）

（3）按血清體積計算

HYP含量（mg/mL）=（ΔA-0.0251）÷ 64.875×V反總÷V樣×2

                 =0.154×（ΔA-0.0251）

V反總：反應(yīng)總體積,，0.3 mL,；V樣：反應(yīng)中樣品體積，0.06mL,；V樣總：加入提取液體積,， mL；W：樣本重量,，g

b.用96孔板測定的計算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=32.4375x+ 0.0251,，R2=0.9991

（1）按樣品重量計算

HYP含量（mg/g 鮮重）=（ΔA-0.0251）÷32.4375×V反總÷(V樣÷V樣總×W)

                = 0.308×（ΔA-0.0251）÷W

（2）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算

HYP含量（mg/104 cell）=（ΔA-0.0251）÷32.4375×V反總÷V樣×V樣總÷細(xì)胞數(shù)量（萬個）= 0.154×（ΔA-0.0251）÷細(xì)胞數(shù)量（萬個）

（3）按血清體積計算

HYP含量（mg/mL）=（ΔA-0.0251）÷32.4375×V反總÷V樣×2

                 = 0.308×（ΔA-0.0251）

V反總：反應(yīng)總體積,，0.3 mL,；V樣：反應(yīng)中樣品體積，0.06mL,；V樣總：加入提取液體積,， mL,；W：樣本重量，g；2,，血清吹干后復(fù)溶的倍數(shù)。

注意事項：

1. 吸光值大于0.8,，樣品適當(dāng)稀釋再測定,，注意計算公式里乘以稀釋倍數(shù)。

2. 試劑有一定的毒性,，請操作時做好防護(hù)措施,，防止吸入或與皮膚接觸。

3. *低檢出限為3.8mg/L,。

上海牧榮生物科技有限公司

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