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檸檬酸（CA）含量測試盒

 微量法100管/96樣

注意：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定,。

測定意義：

CA是生物體內(nèi)常見的有機酸，是重要的食品風(fēng)味物質(zhì),。此外,，CA是三羧酸循環(huán)第一步反應(yīng)的產(chǎn)物。

測定原理：

酸性條件下,，檸檬酸還原Cr6+生成Cr3+,，在545nm處有特征吸收峰；通過測定545nm吸光值的增加,，即可計算出樣品中檸檬酸含量,。

自備儀器和用品：

低溫離心機、水浴鍋,、可調(diào)式移液槍,、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水,。

試劑組成和配置：

試劑一：液體×1瓶,，4℃保存,。

試劑二：液體×1瓶，4℃保存,。

試劑三：液體×1管,，－20℃保存。

試劑四：粉劑×1管,，室溫保存,。臨用前配制，加入2mL試劑一,，充分溶解,。

試劑五：液體×1管，4℃避光保存,。

標(biāo)準(zhǔn)品：液體×1管,，250μmol/L檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)液，4℃保存,。

樣品中檸檬酸提?。?/p>

1. 液體樣品中檸檬酸提取：取0.1mL液體加試劑一0.9mL,，充分混勻,，11000g， 4℃離心10min,，取上清液,，待測。

2. 組織中檸檬酸提?。喊凑战M織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。11000g,，4℃離心10min,，取上清置冰上待測。

3. 線粒體中檸檬酸提?。喊凑战M織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿，600g/min,，4℃離心5min,；取上清至另一EP管中，11000g,，4℃離心10min,，棄上清（此上清液可用于細(xì)胞質(zhì)CA含量測定）；向沉淀中加試劑二200μl,，以及試劑三2μl,，充分懸浮溶解,，11000g,，4℃離心10min,，取上清液，待測,。

4. 細(xì)菌,、真菌中：按照細(xì)胞數(shù)量（104個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w,，超聲3秒,，間隔7秒，總時間3min）,；11000g,，4℃離心10min，取上清置冰上待測,。

測定操作：

1. 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min,，調(diào)節(jié)波長到545 nm，蒸餾水調(diào)零,。

2. 試劑一置于30℃水浴中預(yù)熱30min。

3. 空白管：取0.5 mL EP管,，依次加入20μL蒸餾水，140μL試劑一,，20μL試劑四,，20μL試劑五,，混勻后室溫靜置30min，于545nm測定吸光度,，記為A空白管。

4. 標(biāo)準(zhǔn)管：取0.5 mL EP管,，依次加入20μL標(biāo)準(zhǔn)液，140μL試劑一,，20μL試劑四，20μL試劑五,，混勻后室溫靜置30min,，于545nm測定吸光度,，記為A標(biāo)準(zhǔn)管。

5. 測定管：取0.5 mL EP管,，依次加入20μL上清液,，140μL試劑一，20μL試劑四,，20μL試劑五,，充分混勻后室溫靜置30min，于545nm測定吸光度,，記為A測定管。

注意：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需測定一次,。

計算公式：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

按液體樣品的體積計算

檸檬酸含量（nmol/L）= [C標(biāo)準(zhǔn)液×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)]×樣品稀釋倍數(shù)×V總

= 2500×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)

C標(biāo)準(zhǔn)液：250μmol/L=0.25 m mol/L,；樣品稀釋倍數(shù)：（0.1 mL樣品+0.9mL試劑一）÷ 0.1 mL樣品=10；V總：1mL,。

按組織質(zhì)量計算

檸檬酸含量（nmol/g 鮮重）= [C標(biāo)準(zhǔn)液×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)]×V總÷W

= 250×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管) ÷W

C標(biāo)準(zhǔn)液：250 μ mol/L,；V總：上清液總體積，1.0 mL=0.001 L,；W：樣品質(zhì)量,，g。

按蛋白含量計算

檸檬酸含量（nmol/mg prot）= [C標(biāo)準(zhǔn)液×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)]÷Cpr

= 250×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管) ÷Cpr

C標(biāo)準(zhǔn)液：250 μ mol/L=0.25μ mol/mL,；Cpr：上清液蛋白質(zhì)含量,，mg/mL。

按細(xì)胞數(shù)量計算

檸檬酸含量（nmol/104 cell）= [C標(biāo)準(zhǔn)液×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)]×V總÷細(xì)胞數(shù)量

= 250×(A測定管－A空白管) ÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管) ÷細(xì)胞數(shù)量

C標(biāo)準(zhǔn)液：250 μ mol/L,；V總：上清液總體積,，1.0 mL=0.001 L；

b.使用96孔板測定的計算公式如下

按液體樣品的體積計算

檸檬酸含量（nmol/L）= [C標(biāo)準(zhǔn)液×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)]×樣品稀釋倍數(shù)×V總

= 2500×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)

C標(biāo)準(zhǔn)液：250μmol/L=0.25 m mol/L,；樣品稀釋倍數(shù)：（0.1 mL樣品+0.9mL試劑一）÷ 0.1 mL樣品=10,；V總：1mL。

按組織質(zhì)量計算

檸檬酸含量（nmol/g 鮮重）= [C標(biāo)準(zhǔn)液×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)]×V總÷W

= 250×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管) ÷W

C標(biāo)準(zhǔn)液：250 μ mol/L,；V總：上清液總體積,，1.0 mL=0.001 L；W：樣品質(zhì)量,，g,。

按蛋白含量計算

檸檬酸含量（nmol/mg prot）= [C標(biāo)準(zhǔn)液×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)]÷Cpr

= 250×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管) ÷Cpr

C標(biāo)準(zhǔn)液：250 μ mol/L=0.25μ mol/mL；Cpr：上清液蛋白質(zhì)含量,，mg/mL,。

按細(xì)胞數(shù)量計算

檸檬酸含量（nmol/104 cell）= [C標(biāo)準(zhǔn)液×(A測定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)]×V總÷細(xì)胞數(shù)量

= 250×(A測定管－A空白管) ÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管) ÷細(xì)胞數(shù)量

C標(biāo)準(zhǔn)液：250 μ mol/L；V總：上清液總體積,，1.0 mL=0.001 L,；

注意事項：

1. 樣品處理等過程均需要在冰上進(jìn)行,。

2. 試劑四需現(xiàn)配現(xiàn)用，配置好的一周內(nèi)使用完,；

3. 試劑五為易致癌物質(zhì),，實驗過程中，需佩戴手套,，避免試劑五濺到皮膚上,。

4. 檸檬酸提取液不能用于蛋白含量測定，如需測定蛋白含量,，需另取組織,，使用本公司BCA試劑盒進(jìn)行測定。

上海牧榮生物科技有限公司

1. 國內(nèi)試劑耗材經(jīng)銷代理,。

2. 國外試劑的訂購,。可提供歐美實驗室品牌的采購方案,。

3. 提供加急物流處理,，進(jìn)口貨物，最快交期1-2周,。

4. 進(jìn)出口貨物代理服務(wù),。

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7. 公司突出創(chuàng)新思維,，提高工作效能,，減低運作成本，為客戶提供優(yōu)惠的價格,。

檸檬酸（CA）含量測試盒