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果膠酶測試盒
微量法100T/48S
注意:正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定,。
測定意義
果膠酶(pectinase)是一類分解果膠質(zhì)酶類的總稱,,包括原果膠酶,果膠酯酶,,多聚半乳糖醛酸酶和果膠裂解酶四大類,廣泛存在于植物果實和微生物中,,主要用于食品,、釀酒、環(huán)保,、醫(yī)藥,、紡織及日化用品行業(yè)。
測定原理
果膠酶水解果膠生成半乳糖醛酸,,具有還原性醛基,,與DNS試劑反應(yīng)生成紅棕色物質(zhì),在540nm有特征吸收峰,,測定540nm處吸光值變化可計算得果膠酶活性,。
自備實驗用品及儀器
天平、低溫離心機,、可見分光光度計/酶標(biāo)儀,、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋,。
試劑組成和配制
提取液:液體100mL×1瓶,,4℃保存。
試劑一:液體20mL×1瓶,,4℃保存,。
試劑二:粉劑×2瓶,4℃保存,;臨用前加入7.5mL試劑一,,50℃加熱溶解,用不完的試劑4℃保存一周,。
試劑三:液體20mL×1瓶,,4℃避光保存。
酶液提取
1.組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,,加入1mL提取液),,進行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min,,取上清,,置冰上待測。
2.細菌,、真菌:按照細胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細胞加入1mL提取液),,冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,,超聲3秒,間隔7秒,,總時間3min),;然后10000g,4℃離心10min,,取上清置于冰上待測,。
3. 細胞培養(yǎng)液等:直接檢測。
測定操作表
對照管 | 測定管 | |
試劑二(µL) | 120 | 120 |
50℃水浴溫育5min | ||
樣本(µL) | 30 | |
煮沸樣本(µL) | 30 | |
混勻,,50℃水浴反應(yīng)30min | ||
試劑三(µL) | 150 | 150 |
沸水浴5min,,冰浴冷卻終止反應(yīng),8000g,,4℃,,離心10min,蒸餾水調(diào)零,,取上清于微量石英比色皿或96孔板測定540nm處吸光值A(chǔ),,△A=A測定管-A對照管。每個測定管需設(shè)一個對照管,。 |
酶活性計算公式
用微量石英比色皿測定的計算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 3.9642x - 0.008,;R2 = 0.9996;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度,,mg/mL,;y為吸光值。
1.按照蛋白濃度計算
酶活性定義:在50℃,,pH3.5條件下,,每毫克蛋白每小時分解果膠產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。
果膠酶活性(mg/h/mg prot)= (ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷(V樣×Cpr)÷T
= 2.523×(ΔA+0.008)÷Cpr
2.按照樣本質(zhì)量計算
酶活性定義:在50℃,,pH3.5條件下,,每克樣本每小時分解果膠產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。
果膠酶活性(mg/h /g 鮮重)=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷(V樣×W÷V樣總)÷T
= 2.523×(ΔA+0.008)÷W
3. 按細胞數(shù)量計算
酶活性定義:在50℃,,pH3.5條件下,,每104細胞每小時分解果膠產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。
果膠酶活性(mg/h /104cell)=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷(V樣×細胞數(shù)量÷V樣總)÷T
= 2.523×(ΔA+0.008)÷細胞數(shù)量
4.細胞培養(yǎng)液
酶活性定義:在50℃,,pH3.5條件下,,每毫升培養(yǎng)液每小時分解果膠產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。
果膠酶活性(mg/h /mL)=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷V樣÷T=2.523×(ΔA+0.008)
V反總:反應(yīng)總體積,,0.15mL,;V樣:反應(yīng)中樣本體積,0.03mL,;V樣總:加入提取液體積,,1mL,;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL,;W,,樣本質(zhì)量,g,;T:反應(yīng)時間,,0.5h
用96孔板測定的計算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 1.9821x - 0.008,R2 = 0.9996,;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度,,mg/mL,;y為吸光值,。
1.按照蛋白濃度計算
酶活性定義:在50℃,pH3.5條件下,,每毫克蛋白每小時分解果膠產(chǎn),。生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。
果膠酶活性(mg/h/mg prot)=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反總÷(V樣×Cpr)÷T
= 5.045×(ΔA+0.008)÷Cpr
2.按照樣本質(zhì)量計算
酶活性定義:在50℃,,pH3.5條件下,,每克樣本每小時分解果膠產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。
果膠酶活性(mg/h/g 鮮重)=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反總÷(V樣×W÷V樣總)÷T
= 5.045×(ΔA+0.008)÷W
3. 按細胞數(shù)量計算
酶活性定義:在50℃,,pH3.5條件下,,每104細胞每小時分解果膠產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。
果膠酶活性(mg/h /104cell)=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反總÷(V樣×細胞數(shù)量÷V樣總)÷T
= 5.045×(ΔA+0.008)÷細胞數(shù)量
4.細胞培養(yǎng)液
酶活性定義:在50℃,,pH3.5條件下,,每毫升培養(yǎng)液每小時分解果膠產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。
果膠酶活性(mg/h/mL)=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反總÷V樣÷T=5.045×(ΔA+0.008)
V反總:反應(yīng)總體積,,0.15mL,;V樣:反應(yīng)中樣本體積,0.03mL,;V樣總:加入提取液體積,,1mL;Cpr:樣本蛋白濃度,,mg/mL,;W,樣本質(zhì)量,,g,;T:反應(yīng)時間,0.5h
注意事項
試劑二若有沉淀析出,,請置于50℃加熱溶解,。
測定之前請先做預(yù)實驗,,如果吸光值較高或較低,請用提取液做適當(dāng)?shù)南♂尰蛘呒哟髽颖玖?,并在計算公式中乘以稀釋倍?shù)或者以實際加入的樣本體積參與計算,。
煮沸樣本建議在沸水中煮沸10分鐘,以將酶滅活,。
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