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果膠裂解酶測試盒

微量法100T/48S

注意：正式測定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定,。

測定意義

果膠裂解酶（EC4.2.2.10）是果膠酶的重要組成部分,，是一種能降解植物細(xì)胞壁，導(dǎo)致植物組織軟化甚至死亡的解聚酶，來源比較廣泛,，主要來源于微生物,，可用于果汁、果酒的澄清,，提高水果出汁率,，植物病毒的純化，紙漿的漂白和紡織品的生物精煉,，在減少環(huán)境污染和降低能源消耗方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值,。

測定原理

果膠裂解酶作用于果膠中的α-1,4糖苷鍵，生成在還原端C4和C5之間位置具有不飽和鍵的不飽和寡聚半乳糖醛酸,，在235nm處有特征吸收峰,。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器

天平、低溫離心機(jī),、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀,、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、恒溫水浴鍋,。

試劑組成和配制

提取液：液體100mL×1瓶,，4℃保存。

試劑一：液體6mL×1瓶,，4℃保存,。

試劑二：液體6mL×1瓶，4℃保存,。

試劑三：液體6mL×1瓶,，4℃保存。

酶液提取

1．組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL提取液）,，進(jìn)行冰浴勻漿。10000g ,，4℃離心10min,，取上清，置冰上待測,。

2．細(xì)菌,、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w,，超聲3秒,，間隔7秒，總時(shí)間3min）,；然后10000g,，4℃,，離心10min，取上清置于冰上待測,。

3. 培養(yǎng)液：直接測定,。

測定操作表

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min,，調(diào)節(jié)波長至235nm,，蒸餾水調(diào)零。

2. 操作表

酶活性計(jì)算公式

1. 用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下

1. 組織中PL活性

（1）按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義：在40℃,，pH5.5條件下,，每毫克蛋白每分鐘分解果膠產(chǎn)生1nmol不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PL活性（nmol/min/mg prot）= △A÷（ε×d）×V反總÷（V樣×Cpr）÷T

= 64.1×△A÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義：在40℃,，pH5.5條件下,，每克組織每分鐘分解果膠產(chǎn)生1nmol不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PL活性（nmol/min/g 鮮重）= △A÷（ε×d）×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T

= 64.1×△A÷W

2. 細(xì)菌,、真菌PL活性

酶活性定義：在40℃,，pH5.5條件下，每104個(gè)細(xì)胞每分鐘分解果膠產(chǎn)生1nmol不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為一個(gè)酶活力單位,。

PL活性（nmol/min/104cell）= △A ÷（ε×d）×V反總÷（V樣×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總）÷T 

 = 64.1×△A÷細(xì)胞數(shù)量

3. 培養(yǎng)液PL活性

酶活性定義：在40℃,，pH5.5條件下，每毫升培養(yǎng)液每分鐘分解果膠產(chǎn)生1nmol不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為一個(gè)酶活力單位,。

PL活性（nmol/min/mL）= △A÷（ε×d）×V反總÷V樣÷T

= 64.1×△A

ε：不飽和半乳糖醛酸摩爾消光系數(shù)：5200L/mol/cm,；d：比色皿光徑，1cm,；V反總：反應(yīng)總體積,，0.2mL；V樣：反應(yīng)體系中樣本體積,，0.02mL,；V樣總：加入提取液體積，1mL,；Cpr：樣本蛋白濃度,，mg/mL；W,，樣本質(zhì)量,，g；T：反應(yīng)時(shí)間,，30min

2. 用96孔板測定的計(jì)算公式如下

1. 組織中PL活性

（1）按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義：在40℃,，pH5.5條件下,，每毫克蛋白每分鐘分解果膠產(chǎn)生1nmol不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PL活性（nmol/min/mg prot）= △A÷（ε×d）×V反總÷（V樣×Cpr）÷T

= 128.2×△A÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義：在40℃,，pH5.5條件下,，每克組織每分鐘分解果膠產(chǎn)生1nmol不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PL活性（nmol/min/g 鮮重）= △A÷（ε×d）×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T

= 128.2×△A÷W

2. 細(xì)菌,、真菌PL活性

酶活性定義：在40℃,，pH5.5條件下，每104個(gè)細(xì)胞每分鐘分解果膠產(chǎn)生1nmol不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為一個(gè)酶活力單位,。

PL活性（nmol/min/104cell）=△A÷（ε×d）×V反總÷（V樣×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總）÷T 

    = 128.2×△A÷細(xì)胞數(shù)量

3. 培養(yǎng)液PL活性

酶活性定義：在40℃,，pH5.5條件下，每毫升培養(yǎng)液每分鐘分解果膠產(chǎn)生1nmol不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為一個(gè)酶活力單位,。

PL活性（nmol/min//mL）= △A÷（ε×d）×V反總÷V樣÷T

= 128.2×△A

ε：不飽和半乳糖醛酸摩爾消光系數(shù)：5200L/mol/cm,；d：比色皿光徑，0.5cm,；V反總：反應(yīng)總體積,，0.2mL；V樣：反應(yīng)體系中樣本體積,，0.02mL,；V樣總：加入提取液體積，1mL,；Cpr：樣本蛋白濃度,，mg/mL；W,，樣本質(zhì)量,，g；T：反應(yīng)時(shí)間,，30min

上海牧榮生物科技有限公司

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