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果糖1,6二磷酸醛縮酶(FBA)測試盒

微量法100T/96S

注意：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定,。

測定意義

植物葉綠體中果糖1,6-二磷酸醛縮酶是光合作用中參與calvin循環(huán)的重要酶。催化果糖1,6-二磷酸和景天庚酮糖1,7-二磷酸的合成反應(yīng),，在各種逆境脅迫下表現(xiàn)不同的響應(yīng),。

測定原理

果糖1,6-二磷酸醛縮酶催化果糖1,6-二磷酸生成3-磷酸甘油醛和磷酸二羥丙酮，在磷酸丙糖異構(gòu)酶和α-磷酸甘油脫氫酶作用下催化NADH和磷酸二羥丙酮生成NAD和α-磷酸甘油,，340nm處吸光值的變化可反映果糖1,6-二磷酸醛縮酶活性的高低,。

自備實驗用品及儀器

天平、震蕩儀,、低溫離心機,、研缽、紫外分光光度計/酶標(biāo)儀,、微量石英比色皿/96孔板,。

試劑組成和配制   

提取液一：液體100mL×1瓶，4℃保存,。

提取液二：液體100mL×1瓶,，4℃保存。

試劑一：液體10mL×1瓶,，4℃避光保存,。

試劑二：粉劑×1瓶，-20℃避光保存,。臨用前加2mL蒸餾水充分溶解,；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融,。

試劑三：粉劑×1瓶,，-20℃避光保存。臨用前加2 mL蒸餾水充分溶解,；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融。

試劑四：粉劑×1瓶,，-20℃避光保存,。臨用前加2 mL蒸餾水充分溶解,；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融。

試劑五：液體2mL×1瓶,，4℃避光保存,。

酶液提取

①總FDA酶提取：建議稱取約0.1g樣本,，加入1mL提取液一,，冰浴勻漿后超聲破碎（冰浴,，200W，破碎3s,，間歇7s,，總時間1min），然后4℃,，8000g離心10min,，取上清測定。

②胞漿和葉綠體FDA酶的分離：按照植物組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5～10的比例（建議稱取約0.1g樣本,，加入1mL提取液一）,，冰浴勻漿后于4℃，200g離心5min,，棄沉淀,，取上清在4℃，8000g離心10min,，取上清用于測定胞漿FDA酶活性,，取沉淀加1mL提取液二，震蕩溶解后超聲破碎（冰浴,，200W,，破碎3s，間歇7s,，總時間1min）,，然后4℃，8000g離心10min,，取上清測定葉綠體中FDA酶活性,。

建議測定總FDA酶活性，按照步驟①提取粗酶液,，若需要分別測定胞漿和葉綠體中的FDA,，則按照步驟②提取粗酶液。

測定操作

1. 紫外分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min,，調(diào)節(jié)波長至340nm,，蒸餾水調(diào)零。

2. 取微量石英比色皿/96孔板,，依次加入100μL試劑一,，20μL試劑二，20μL試劑三,，20μL試劑四,，20μL試劑五，20μL粗酶液,，充分混勻,，記錄340nm處10s的吸光值A(chǔ)1和310s的吸光值A(chǔ)2,，△A=A1-A2

計算公式

1. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按照樣本蛋白濃度計算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位,。

FDA（nmol/min/mg prot）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計算

酶活單位定義：每克組織每分消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位,。

FDA（nmol/min/g 鮮重）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=321.54×ΔA÷W

（3）按照細胞數(shù)量計算

酶活單位定義：每104個細胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

FDA（nmol/min/104 cell）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×細胞數(shù)量÷V樣總) ÷T

                = 321.54×ΔA÷細胞數(shù)量

（4）按照液體體積計算

酶活單位定義：每毫升液體每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位,。

FDA（nmol/min/mL）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷V樣÷T=321.54×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積,，0.2mL,；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L/mol /cm,；d：比色皿光徑,，1cm；V樣：加入樣本體積,，0.02mL,；V樣總：加入提取液體積，1mL,；T：反應(yīng)時間,，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量，g

2. 用96孔板測定的計算公式如下

（1）按照樣本蛋白濃度計算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位,。

FDA（nmol/min/mg prot）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T= 643.08×ΔA÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計算

酶活單位定義：每克組織每分消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位,。

FDA（nmol/min/g 鮮重）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T= 643.08×ΔA÷W

（3）按照細胞數(shù)量計算

酶活單位定義：每104個細胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

FDA（nmol/min/104 cell）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×細胞數(shù)量÷V樣總) ÷T

                = 643.08×ΔA÷細胞數(shù)量

（4）按照液體體積計算

酶活單位定義：每毫升液體每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位,。

FDA（nmol/min/mL）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷V樣÷T= 643.08×ΔAV反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL,；ε：NADH摩爾消光系數(shù),，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑,，0.5cm,；V樣：加入樣本體積，0.02mL,；V樣總：加入提取液體積,，1mL；T：反應(yīng)時間,，5 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量,，g

上海牧榮生物科技有限公司

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