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亮氨酸氨基肽酶（LAP）測試盒

微量法 100管/96樣

正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：                           

LAP是一類能水解肽鏈N-末端為亮氨酸的酶,，廣泛存在于肝、腎、胰等組織中,，尤其以肝臟中含量最為豐富。各類肝病患者因肝細胞損傷,，血清LAP的活性均有不同程度的升高,，因此，血清LAP活性的檢測能從不同側(cè)面反映各種肝病的發(fā)生和發(fā)展,。

測定原理：

LAP分解L-亮氨酰對硝基苯胺生成對硝基苯胺,，后者在405nm有最大吸收峰，通過測定吸光值升高速率來計算LAP活性,。

自備用品：

酶標儀/可見分光光度計,、臺式離心機、水浴鍋,、可調(diào)式移液器,、96孔板/微量石英比色皿、研缽,、冰和蒸餾水,。

試劑的組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存； 

試劑一：液體15mL×1瓶,，4℃保存,；

試劑二：粉劑×1瓶，-20℃保存,；

樣本的前處理： 

1,、細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi),，離心后棄上清,；按照細菌或細胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為1000~5000：1的比例（建議2000萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴,，功率20％或200W,，超聲3s，間隔10s,，重復30次）,；8000g 4℃離心10min，取上清,，置冰上待測,。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）,，進行冰浴勻漿,。8000g 4℃離心10min，取上清,，置冰上待測,。

2、血清（漿）樣品：直接檢測,。

LAP測定步驟：

1. 分光光度計或酶標儀預熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長至405nm，蒸餾水調(diào)零,。

2. 將試劑二轉(zhuǎn)移至試劑一中充分溶解（如較難溶解，可50℃水浴加熱約30min促進溶解）,；在37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴10min以上,；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融,。

3. 在微量石英比色皿或96孔板中加入50μL樣本和150μL試劑一,，混勻后立即記錄405nm處初始吸光值A(chǔ)1和 2min后的吸光值A(chǔ)2，計算ΔA=A2-A1,。

注意事項：若ΔA大于0.5,，需將酶液用提取液稀釋，計算公式中乘以相應稀釋倍數(shù),。使A2-A1小于0.5,，可提高檢測靈敏度,。

LAP活力單位的計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、血清（漿）LAP活力的計算:

單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘生成1 nmol的對硝基苯胺定義為一個酶活力單位,。

LAP（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T=205.8×ΔA

2,、組織、細菌或細胞中LAP活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol 對硝基苯胺定義為一個酶活力單位,。

LAP（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=205.8×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol 對硝基苯胺定義為一個酶活力單位,。

LAP（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=205.8×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1 nmol 對硝基苯胺定義為一個酶活力單位。

LAP（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(2000×V樣÷V樣總) ÷T=0.103×ΔA

V反總：反應體系總體積,，2×10-4 L,；ε：對硝基苯胺摩爾消光系數(shù)，9.72×103 L / mol /cm,；d：比色皿光徑,，1cm；V樣：加入樣本體積,，0.05 mL,；V樣總：加入提取液體積，1 mL,；T：反應時間,，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量，g,；2000：細菌或細胞總數(shù),，2000萬。

b.用96孔板測定的計算公式如下

1,、血清（漿）LAP活力的計算:

單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘生成1 nmol的對硝基苯胺定義為一個酶活力單位,。

LAP（nmol/min /mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T=411.5×ΔA

2、組織,、細菌或細胞中LAP活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol 對硝基苯胺定義為一個酶活力單位,。

LAP（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷ (V樣×Cpr) ÷T=411.5×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol 對硝基苯胺定義為一個酶活力單位。

LAP（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=411.5×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1 nmol 對硝基苯胺定義為一個酶活力單位,。

LAP（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(2000×V樣÷V樣總) ÷T=0.206×ΔA

V反總：反應體系總體積,，2×10-4 L；ε：對硝基苯胺摩爾消光系數(shù),，9.72×103 L / mol /cm,；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積,，0.05 mL,；V樣總：加入提取液體積，1 mL,；T：反應時間,，2min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量，g,；2000：細菌或細胞總數(shù),，2000萬。

上海牧榮生物科技有限公司

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