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乙酸激酶（ACK)測試盒

正式測定前務(wù)必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：                           

ACK主要存在于微生物中,，催化乙酸和ATP生成乙酰磷酸和ADP,，是細菌碳代謝和能量代謝的關(guān)鍵酶，尤其是在古細菌甲烷合成代謝中起著中樞作用,。

測定原理：

（1）ACK催化乙酸鈉和ATP生成乙酰磷酸和ADP,，（2）丙酮酸激酶催化ADP和PEP生成ATP和丙酮酸，（3）乳酸脫氫酶催化丙酮酸和NADH生成乳酸和NAD+,，（4）在340nm下測定NADH氧化生成NAD+速率,，即可反映ACK活性。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標儀,、臺式離心機,、水浴鍋、可調(diào)式移液器,、微量石英比色皿/96孔板,、研缽、冰和蒸餾水

試劑組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶,，4℃保存,；

試劑一：液體30mL×1瓶，4℃保存,；

試劑二：粉劑×2瓶,，-20℃保存；

試劑三：液體500μL×1支,，4℃保存,；

樣本的前處理：

1、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi),，離心后棄上清,；按照細菌或細胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴,，功率20％或200W,，超聲3s，間隔10s,，重復30次）,；15000g 4℃離心10min，取上清,，置冰上待測,。

2,、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）,，進行冰浴勻漿,。15000g 4℃離心10min，取上清,，置冰上待測,。

測定步驟：

1. 分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm,，蒸餾水調(diào)零,。

2. 樣本測定

（1）工作液的配置：臨用前取試劑二一瓶，加入10mL試劑一和200μL試劑三,，充分混合溶解,，置于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴5min；現(xiàn)配現(xiàn)用,；

（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入20μL樣本和180μL工作液,，混勻，立即記錄340nm處20s時的吸光值A(chǔ)1和 3min20s后的吸光值A(chǔ)2,，計算ΔA=A1-A2,。

ACK活性計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

ACK（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=536×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位,。

ACK（nmol/min /g 鮮重）= [ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=536×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位,。

ACK（nmol/min /104 cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=1.072×ΔA

V反總：反應體系總體積，2×10-4 L,；ε：NADH摩爾消光系數(shù),，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑,，1cm,；V樣：加入樣本體積，0.02 mL,；V樣總：加入提取液體積,，1 mL；T：反應時間,，3 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量,，g；500：細菌或細胞總數(shù),，500萬,。

b.用96孔板測定的計算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

ACK（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1072×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位,。

ACK（nmol/min /g 鮮重）= [ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=1072×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位,。

ACK（nmol/min /104 cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總)  ÷T=2.144×ΔA

V反總：反應體系總體積，2×10-4 L,；ε：NADH摩爾消光系數(shù),，6.22×103 L / mol /cm；d：96孔板光徑,，0.5cm,；V樣：加入樣本體積，0.02 mL,；V樣總：加入提取液體積,，1 mL；T：反應時間,，3 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量,，g；500：細菌或細胞總數(shù),，500萬,。

上海牧榮生物科技有限公司

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