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中性轉(zhuǎn)化酶（NI）測試盒

正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

蔗糖轉(zhuǎn)化酶（Invertase,，Ivr）催化蔗糖不可逆地分解為果糖和葡萄糖，是高等植物蔗糖代謝關(guān)鍵酶之一,。根據(jù)最適 pH，將高等植物Ivr分為酸性轉(zhuǎn)化酶（AI）和中性轉(zhuǎn)化酶（NI）兩種類型,。                           

NI主要存在于細胞質(zhì)中,，負責(zé)分解細胞質(zhì)中蔗糖為果糖和葡萄糖。

測定原理：

NI催化蔗糖分解產(chǎn)生還原糖,，進一步與3,5－二硝基水楊酸反應(yīng),，生成棕紅色氨基化合物，在510nm有特征光吸收,，在一定范圍內(nèi)510nm光吸收值與還原糖生成量成正比,。通過光吸收增加速率來計算NI活性

自備用品：

可見分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機,、水浴鍋,、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板,、研缽,、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶,，4℃保存;

試劑一：液體20mL×1瓶,，4℃保存;

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存,；臨用前加入10mL試劑一充分溶解備用,；用不完的試劑4℃保存；

試劑三：液體15mL×1瓶,，4℃保存；

粗酶液提?。?/p>

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿,。12000g 4℃離心10min,，取上清，置冰上待測,。

測定步驟和加樣表：

1. 分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長至510nm，蒸餾水調(diào)零,。

2,、樣本測定，（在EP管中依次加入下列試劑）：

混勻,， 37℃準(zhǔn)確水浴30min后,，95℃水浴10min（蓋緊,，以防止水分散失），流水冷卻后充分混勻（以保證濃度不變）

混勻,，95℃水浴10min（蓋緊,，以防止水分散失），流水冷卻后充分混勻,，取200μL至微量石英比色皿或96孔板中,， 510nm處記錄各管吸光值A(chǔ)，如果吸光值大于2,，可以用蒸餾水稀釋后測定（計算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)）,，ΔA=A測定-A對照。每個測定管需設(shè)一個對照管,。

NI活性計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為y = 0.0016x -0.001,；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μg/mL），y為吸光值,。

（1）按蛋白濃度計算：

單位的定義：37℃每mg蛋白每分鐘產(chǎn)生1μg還原糖定義為一個酶活性單位,。

NI活性（μg/min /mg prot）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0016×V1]÷(V1×Cpr ) ÷T=20.8×(ΔA +0.001) ÷Cpr

（2）按鮮重計算：

單位的定義：37℃每g組織每分鐘產(chǎn)生1μg還原糖定義為一個酶活性單位。

NI活性（μg/min /g 鮮重）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0016×V1]÷(W×V1÷V2) ÷T=20.8×(ΔA +0.001) ÷W 

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積,，0.05mL,；V2：加入提取液體積，1mL,；T：反應(yīng)時間,，30min； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；W：樣本鮮重，g,。

b.用96孔板測定的計算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為y = 0.0008x -0.001,；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μg/mL），y為吸光值,。

（1）按蛋白濃度計算：

單位的定義：37℃每mg蛋白每分鐘產(chǎn)生1μg還原糖定義為一個酶活性單位,。

NI活性（μg/min /mg prot）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0008×V1]÷(V1×Cpr ) ÷T=41.6×(ΔA +0.001) ÷Cpr

（2）按鮮重計算：

單位的定義：37℃每g組織每分鐘產(chǎn)生1μg還原糖定義為一個酶活性單位。

NI活性（μg/min /g 鮮重）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0008×V1]÷(W ×V1÷V2) ÷T =41.6×(ΔA +0.001) ÷W 

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積,，0.05mL,；V2：加入提取液體積，1mL,；T：反應(yīng)時間,，30min； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,；W：樣本鮮重,，g。

上海牧榮生物科技有限公司

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