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丙酮酸脫氫酶（PDH)測(cè)試盒

正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義

PDH（EC 1.2.4.1）廣泛存在于動(dòng)物,、植物,、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(PDHC)催化丙酮酸氧化脫羧的限速酶,，催化丙酮酸脫梭生成羥*基-TPP,，把糖酵解和三羧酸循環(huán)連接起來(lái)。

測(cè)定原理

PDH催化丙酮酸脫氫，同時(shí)還原2,6-二氯酚靛酚（2,6-DCPIP）,，從而導(dǎo)致600nm光吸收的減少,。

需自備的儀器和用品

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋,、臺(tái)式離心機(jī),、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板,、研缽,、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制

試劑一：100mL×1瓶,，-20℃保存,；

試劑二：20mL×1瓶，-20℃保存,；

試劑三：1.5mL×1支,，-20℃保存；

試劑四：液體20mL×1瓶,，4℃保存,；

試劑五：粉劑×1瓶，4℃保存,；

樣本的前處理

組織,、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1. 稱取約0.1g組織或收集500萬(wàn)細(xì)胞，加入1mL試劑一和10uL 試劑三,，用冰浴勻漿器或研缽勻漿,。

2. 將勻漿600g，4℃離心5min,。

3. 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中,，11000g,，4℃離心10min。

4. 上清液即胞漿提取物,，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的PDH（此步可選做）,。

5. 在步驟④的沉淀中加入200uL試劑二和2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴,，功率20％或200W,，超聲3秒，間隔10秒,，重復(fù)30次）,，用于線粒體PDH活性測(cè)定。

測(cè)定步驟

1. 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至605nm,，蒸餾水調(diào)零,。

2. 樣本測(cè)定

（1）在試劑五中加入19mL試劑四充分溶解，置于37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴10min,；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融；

（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本和190μL試劑五,，混勻,，立即記錄605nm處初始吸光值A(chǔ)1和 1min后的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A1-A2,。

PDH活性計(jì)算

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位,。

 PDH活性（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=952×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。

PDH活性（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=192×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位,。

PDH活性（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.385×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積,，2×10-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù),，2.1×104 L / mol /cm,；d：比色皿光徑，1cm,；V樣：加入樣本體積,，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積,，0.202 mL,；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL；W：樣本質(zhì)量,，g,；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn),。

b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位,。

 PDH活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1904×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。

PDH活性（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=384×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位,。

PDH活性（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.77×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積,，2×10-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù),，2.1×104 L / mol /cm,；d：96孔板光徑,，0.5cm；V樣：加入樣本體積,，0.01 mL,；V樣總：加入提取液體積，0.202 mL,；T：反應(yīng)時(shí)間,，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量，g,；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),，500萬(wàn)。

上海牧榮生物科技有限公司

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