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更新時(shí)間：2024-05-06 13:54:14瀏覽次數(shù)：498評(píng)價(jià)
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γ谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γGT)測(cè)定（比色法）測(cè)試盒
注意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義：
γ-GT是γ-谷氨酰循環(huán)中的關(guān)鍵酶,，催化GSH降解,。γ-GT催化GSH或者其他γ-谷氨?；衔锷系摩?谷氨?；D(zhuǎn)移到受體,。也可以催化GSH和其他γ-谷氨酰基化合物的水解,，產(chǎn)生谷氨酸鹽,，在細(xì)胞外谷胱甘肽新陳代謝中起了重要的作用。
測(cè)定原理：
γ-GT催化谷氨酰對(duì)硝基苯胺中γ-谷氨?；D(zhuǎn)移給N-甘氨酰甘氨酸,，生成對(duì)硝基苯胺,，在405nm有特征光吸收,；通過(guò)測(cè)定405nm光吸收增加速率，來(lái)計(jì)算γ-GT酶活性,。
自備儀器和用品：
低溫離心機(jī),、水浴鍋,、可調(diào)節(jié)移液器、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀,、微量玻璃比色皿/96孔板,、和蒸餾水
試劑組成和配制：
試劑一：液體100mL×1瓶，4℃保存,。
試劑二：粉劑×1瓶,，4℃保存。
試劑三：液體4mL×1瓶,，4℃保存,。
試劑四：液體14.8mL×1瓶，4℃保存,。
工作液（在試劑二瓶中配制）：臨用前配制,，把試劑三倒入試劑二瓶中，充分溶解（室溫過(guò)低時(shí)可以40℃水浴促進(jìn)溶解）,；然后把試劑四倒入試劑二瓶中,，混勻后室溫保存。
粗酶液提?。?/p>
組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g,，4℃離心15min,，取上清，置冰上待測(cè),。
細(xì)菌,、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w,，超聲3秒,，間隔7秒，總時(shí)間3min）,；然后8000g,，4℃，離心15min,，取上清置于冰上待測(cè),。
3. 血清等液體：直接測(cè)定。
γ-GT測(cè)定操作:
1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min,，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到405 nm,，蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑二置于25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動(dòng)物）水浴中預(yù)熱30min（保證無(wú)沉淀）,。
3. 測(cè)定管：取微量玻璃比色皿或96孔板,，依次加入20μL上清液,，180μL工作液，混勻后于405nm測(cè)定10s和70s時(shí)吸光度,，記為A1和A2,。
γ-GT活性計(jì)算：
標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.006x+0.0016，x為對(duì)硝基苯胺濃度,，y為吸光值,，R2=0.999。
a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
(1). 按蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義：25℃或者37℃中,，每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯胺為1個(gè)酶活單位,。
γ-GT（μmol/min/mg prot）=[ (A2－A1)－0.0016]÷0.006×V反總÷（Cpr×V樣）÷T
=1.67 × [ (A2－A1)－0.0016] ÷ Cpr
(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算
活性單位定義：25℃或者37℃中，每克樣本每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯胺為1個(gè)酶活單位,。
γ-GT（μmol/min/g 鮮重）=[ (A2－A1)－0.0016]÷0.006×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T
=1.67 × [ (A2－A1)－0.0016] ÷W
（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
活性單位定義：25℃或者37℃中,，每104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯胺為1個(gè)酶活單位。
γ-GT（μmol/min/104 cell）=[ (A2－A1)－0.0016]÷0.006×V反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T
=1.67 × [ (A2－A1)－0.0016] ÷細(xì)胞數(shù)量
（4）按液體體積計(jì)算
活性單位定義：25℃或者37℃中,，每毫升液體每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯胺為1個(gè)酶活單位。
γ-GT（μmol/min/mL）= [ (A2－A1)－0.0016]÷0.006×V反總÷V樣÷T
= 1.67 × [ (A2－A1)－0.0016]
V反總：反應(yīng)體系總體積（L）,，200μL=2×10-4L,；Cpr：蛋白濃度（mg/mL）；W ：樣品質(zhì)量,；V樣：反應(yīng)體系中加入上清液體積（mL）,，20μL=0.02 mL；V樣總：提取液體積,，1 mL,；T：反應(yīng)時(shí)間（min），1min,。
b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.003x+0.0016,，x為對(duì)硝基苯胺濃度，y為吸光值,，R2=0.999。
(1). 按蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義：25℃或者37℃中,，每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯胺為1個(gè)酶活單位。
γ-GT（μmol/min/mg prot）=[ (A2－A1)－0.0016]÷0.003×V反總÷（Cpr×V樣）÷T
=3.34× [ (A2－A1)－0.0016] ÷ Cpr
(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算
活性單位定義：25℃或者37℃中,，每克樣本每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯胺為1個(gè)酶活單位。
γ-GT（μmol/min/g 鮮重）=[ (A2－A1)－0.0016]÷0.003×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T
=3.34 × [ (A2－A1)－0.0016] ÷W
（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
活性單位定義：25℃或者37℃中,，每104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯胺為1個(gè)酶活單位,。
γ-GT（μmol/min/104 cell）=[ (A2－A1)－0.0016]÷0.003×V反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T
=3.34 × [ (A2－A1)－0.0016] ÷細(xì)胞數(shù)量
（4）按液體體積計(jì)算
活性單位定義：25℃或者37℃中，每毫升液體每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯胺為1個(gè)酶活單位,。
γ-GT（μmol/min/mL）= [ (A2－A1)－0.0016]÷0.003×V反總÷V樣÷T
= 3.34 × [ (A2－A1)－0.0016]
V反總：反應(yīng)體系總體積（L），200μL=2×10-4L,；Cpr：蛋白濃度（mg/mL）,；W ：樣品質(zhì)量，g,；V樣：反應(yīng)體系中加入上清液體積（mL）,，20μL=0.02 mL；V樣總：提取液體積,，1 mL,；T：反應(yīng)時(shí)間（min），1min,。
注意事項(xiàng)：
培養(yǎng)細(xì)胞中γ-GT活性測(cè)定時(shí),，細(xì)胞數(shù)目須在300萬(wàn)-500萬(wàn)之間，細(xì)胞中γ-GT的提取時(shí)可加試劑一后研磨或超聲波處理,，不能用細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞（防止因?yàn)榈鞍踪|(zhì)變性導(dǎo)致酶失活）,。
配置好的工作液2周內(nèi)使用完畢。
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