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N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶（N-acetyl-β-D-glucosidase, NAG）試劑盒

正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

NAG是溶酶體中的一種酸性水解酶，廣泛存在于各種組織、體液和細胞中,，以前列腺和腎近曲小管細胞內含量最高,。NAG活性變化與機體某些病理狀態(tài)密切相關。

測定原理：

NAG分解β-N-乙酰氨基葡萄糖苷生成對-硝基苯酚,，后者在400nm有最大吸收峰,，通過測定吸光值升高速率來計算NAG活性。

自備用品：

酶標儀/可見分光光度計,、臺式離心機,、水浴鍋、可調式移液器,、96孔板/微量石英比色皿,、研缽、冰和蒸餾水,。

試劑組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶,，4℃保存。

試劑一：粉劑×1瓶,，-20℃保存,；臨用前加入2.5mL蒸餾水，充分溶解備用,；用不完的試劑仍-20℃保存,。

試劑二：液體4mL×1瓶，4℃保存,。

試劑三：液體13mL×1瓶,，4℃保存。

粗酶液提?。?/p>

1,、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清,；按照細菌或細胞數量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液）,，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W,，超聲3s,，間隔10s，重復30次）,；15000g 4℃離心10min,，取上清，置冰上待測,。

2,、組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿,。15000g 4℃離心10min,，取上清，置冰上待測,。

3,、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1. 酶標儀或分光光度計預熱30min以上,，調節(jié)波長至400nm,，蒸餾水調零。

2,、樣本測定（在EP管或96孔板中依次加入下列試劑）：

迅速混勻,，放入37℃保溫30min

充分混勻， 400nm處測定吸光值A,，計算ΔA=A測定-A對照,。每個測定管需設一個對照管。

NAG活性計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1,、標準條件下測定的回歸方程為y = 0.00585x +0.0083,；x為標準品濃度（nmol/mL），y為吸光值,。

2,、血清（漿）NAG活力的計算

單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘產生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。

NAG活力(nmol /min/mL)= [(ΔA-0.0083) ÷0.00585×V反總]÷V樣÷T =39.89×(ΔA-0.0083)

3,、細胞,、細菌和組織中NAG活力的計算

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘產生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。

NAG活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0083) ÷0.00585×V反總]÷(V樣×Cpr)÷T

=39.89×(ΔA-0.0083) ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘產生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位,。

NAG活性(nmol/min/g鮮重)= [(ΔA-0.0083) ÷0.00585×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=39.89×(ΔA-0.0083)÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘產生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位,。

NAG活性(nmol/min /104cell) =[(ΔA-0.0083) ÷0.00585×V反總]÷(500×V樣÷V樣總)÷T

=0.08×(ΔA-0.0083)

V反總：反應體系總體積，0.07mL,；V樣：加入反應體系中樣本體積,，0.01mL；V樣總：加入提取液體積,，1mL,；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL,；W：樣本質量,，g,； 500：細胞或細菌總數,，500萬,；T：反應時間，30min,。

b.用96孔板測定的計算公式如下

1,、標準條件下測定的回歸方程為y = 0.0039x +0.0083；x為標準品濃度（nmol/mL）,，y為吸光值,。

2、血清（漿）NAG活力的計算

單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘產生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位,。

NAG活力(nmol /min/mL)= [(ΔA-0.0083) ÷0.0039×V反總]÷V樣÷T =59.83×(ΔA-0.0083)

3,、細胞、細菌和組織中NAG活力的計算

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘產生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位,。

NAG活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0083) ÷0.0039×V反總]÷(V樣×Cpr)÷T

=59.83×(ΔA-0.0083) ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘產生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位,。

NAG活性(nmol/min/g鮮重)= [(ΔA-0.0083) ÷0.0039×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=59.83×(ΔA-0.0083)÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘產生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。

NAG活性(nmol/min /104cell) =[(ΔA-0.0083) ÷0.0039×V反總]÷(500×V樣÷V樣總)÷T

=0.12×(ΔA-0.0083)

V反總：反應體系總體積,，0.07mL,；V樣：加入反應體系中樣本體積，0.01mL,；V樣總：加入提取液體積,，1mL；Cpr：樣本蛋白質濃度,，mg/mL,；W：樣本質量，g,； 500：細胞或細菌總數,，500萬；T：反應時間,，30min,。

上海牧榮生物科技有限公司

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